流動注射化學發光法測定溶菌酶含量

摘要 基于溶菌酶催化水解殼聚糖的產物氨基葡萄糖，與金溶膠-魯米諾可產生很強的化學發光，建立了流動注射化學發光測定溶菌酶含量的方法。對水解和化學發光反應條件進行了考察。結果表明，pH 4.0、50 ℃水解5 h為最佳水解條件。在金膠、魯米諾及NaOH的濃度分別為0.05， 0.05和10 mmol/L條件下，化學發光檢測效果最好。在優化條件下，溶菌酶濃度在5～800 μg/L范圍內與化學發光強度有良好的線性關系，方法的檢出限為4 μg/L。本方法可用于蛋清中溶菌酶含量的檢測。

關鍵詞 化學發光; 溶菌酶; 殼聚糖; 魯米諾

2010-11-25收稿；2011-03-15接受

本文系863計劃專題項目（No.2009AA03Z331）資助

E-mail: xyhu@yzu.edu.cn

1 引言

溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，廣泛存在于植物、鳥類、哺乳動物、細菌等生物體內及分泌物中。作為一種動物體內在的抗體，它可以通過溶解細菌尤其是革蘭氏陽性菌的細胞壁，阻止細菌的入侵。因此，溶菌酶常被用作肉類、奶酪、蔬菜和新鮮水果等物品的防腐劑，也有一些文獻報道了其作為抗感染和潰瘍藥物的應用^［1］。溶菌酶的使用存在一些爭議，因為有個案研究顯示，溶菌酶會導致過敏^［2］。所以，研究溶菌酶的檢測方法很有意義。目前，檢測溶菌酶的方法有免疫檢測法^［3］、分光光度法^［4］、 HPLC法^［5］、質譜法^［6］及熒光法^［7，8］等。

化學發光法具有簡單、快速、靈敏度高、線性范圍寬等優點，其中應用最廣泛的是魯米諾體系^［9～14］。Zhang等^［15］報道的納米金屬材料催化魯米諾化學發光體系，可用于含氨基化合物的檢測^{［16，17］}。其化學發光機理為：納米金屬材料催化溶解氧氧化含氨基的螯合劑生成H₂O₂，進而氧化魯米諾產生化學發光。此基礎上，本研究利用溶菌酶催化水解殼聚糖，產生氨基葡萄糖，再被納米金-魯米諾化學發光體系所檢測，建立了溶菌酶的化學發光檢測新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑IFFM-E型流動注射化學發光儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）； Tecnai-12（120KV）透射電鏡（飛利浦公司）；PHs-25型數顯pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

20 mg/L溶菌酶儲備液：將20 mg溶菌酶（二次結晶， 活力≥20000.0 U/mg）溶于水，定容至1000 mL，4 ℃冷藏備用；1%殼聚糖儲備液：稱取10.00 g殼聚糖（1.5×10³ kDa）溶于1000 mL醋酸（1%）-醋酸鈉（1%）緩沖液中；10 mmol/L魯米諾（陜西師范大學）儲備液; 1%檸檬酸鈉溶液; 0.2 mmol/L氯金酸溶液; 0.1 mol/L NaOH; 0.1 mol/L HCl，以上試劑為分析純，本實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 金膠的制備

采用文獻［18］的方法，將100 mL氯金酸溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入3.00 mL檸檬酸鈉溶液，攪拌條件下回流15 min，去掉熱源繼續攪拌10 min，得粒徑為19 nm的納米金膠。將制得的金膠冷卻至室溫，放于冰箱 （4 ℃）中備用。通過改變檸檬酸鈉溶液的加入量，可以制得不同顆粒的金膠。

2.3 殼聚糖的水解

分別移取殼聚糖儲備液2.00 mL，再加入不同量溶菌酶溶液，用HCl或NaOH調至pH＝4.0，稀釋至50.00 mL，50 ℃恒溫水解5 h得水解樣。同時，制得不加溶菌酶的樣品空白。

2.4 化學發光檢測

流動注射發光裝置如圖1所示，樣品空白C與水解樣S通過換向閥交替進入管路，再與堿性魯米諾溶液R₁（0.05 mmol/L魯米諾＋20 mmol/L NaOH）混合，混合液在化學發光池與金溶膠R₂（0.05 mmol/L）接觸，化學發光訊號被光電倍增管PMT檢測。記錄發光強度與時間的關系曲線，根據峰值高度計算溶菌酶含量。

各管路流量均為2.0 mL/min，流通管內徑2 mm。

3 結果與討論

3.1 水解條件

改變殼聚糖儲備液的體積，并于不同的水解時間取樣進行分析。結果表明，隨著殼聚糖用量增加、水解時間的增長，被檢出的化學發光增強。當殼聚糖體積大于2 mL、水解時間達5 h，發光強度變化較緩。過大的殼聚糖體積及過長的時間均導致基線的噪音過大。本研究中殼聚糖體積選擇為2 mL、水解時間為5 h。

考察了pH值對水解速度的影響，結果如圖2。pH 4.0時，水解產物被檢發光強度最高且較穩定。

檢測了不同溫度下，水解產物的發光強度（圖3），當溫度低于50 ℃時，兩者呈正相關性；溫度高于50 ℃，發光強度反而下降。

綜上所述， pH 4.0的0.04%殼聚糖（加入儲備液2.00 mL）作為溶菌酶的待水解樣、50 ℃水解5 h得水解樣用于測定。

3.2 化學發光檢測條件

改變金膠制備過程中檸檬酸鈉的用量，制得不同顆徑的金膠，將其分別用于檢測。實驗表明，金的催化效果與其顆徑相關，其中19 nm顆徑的金膠作為試劑，發光強度最大。圖4為其透射電鏡圖。

考察了金膠濃度、魯米諾濃度及魯米諾中NaOH濃度，對化學發光強度的影響。固定其它物質濃度，改變金膠濃度，考察金膠濃度對化學發光強度的影響，結果如圖5。隨著金膠濃度的增大，發光強度增強，當金膠濃度達0.05 mmol/L（以Au原子計）時，發光強度變化較緩。

當魯米諾濃度和NaOH濃度較小時，化學發光強度隨兩者濃度的增加而增大；當魯米諾濃度大于0.05 mmol/L、NaOH濃度達 10 mmol/L時，化學發光強度基本保持穩定。

本研究中金膠、魯米諾及NaOH的濃度分別選擇0.05， 0.05和10 mmol/L。

3.3 標準曲線、檢出限

在以上選定條件下，對加入不同量溶菌酶的水解樣進行測定。結果表明，當水解樣中溶菌酶濃度在5～800 μg/L范圍內，發光強度與其呈良好線性關系，如圖6。線性方程為：

3.4 干擾實驗

向溶菌酶含量為200 μg/L的待水解樣中分別加入不同干擾物，當Fe^3＋（2 mg/L）、血紅蛋白（Hb）（10 g/L）、牛血清白蛋白BSA（10 mg/L）、葡萄糖（1000 mg/L）、乳糖（1000 mg/L）、淀粉（2000 mg/L）分別存在時，相對誤差小于5%。

3.5 樣品檢測

取雞蛋清1.00 mL，稀釋并定容至200.00 mL，取1.00 mL稀釋液至水解樣中，并進行檢測。由發光強度計算雞蛋中溶菌酶含量，并進行加標回收實驗，結果如表1。

本方法線性范圍較寬，檢出限低，用于雞蛋清中溶菌酶含量的檢測，結果令人滿意。

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Detection of Lysozyme by Flow Injection Chemiluminescence

JI Zheng-Ping， WANG Jun， HAN Jin， HU Xiao-Ya^*

（College of Chemistry and Chemical Engineering of Yangzhou University，Institute for Food Chemistry of Yangzhou University， Yangzhou 225002）

Abstract Basing on the fact that glucosamine which is hydrolysate of chitosan with lysozyme can react with luminol-gold nanoparticles giving birth to chemiluminescence， a flow injection chemiluminescence （CL） method was proposed for the detection of lysozyme. The hydrolysis condition and the CL condition were studied. It was found that the optimized experimental conditions of hydrolysis were pH 4.0， 50 ℃ and hydrolysis for 5 h. When the concentrations of gold colloids， luminol and NaOH were 0.05， 0.05 and 10 mmol/L respectively， the optimized results of CL measurements were obtained. Under the conditions， a linear relationship was obtained between the CL intensity and the concentrations of lysozyme in the range of 5 to 800 μg/L， with the detection limit of 4 μg/L. This method has been successfully applied to the determination of lysozyme in egg white.

Keywords Chemiluminescence; Lysozyme; Chitosan; Luminol

（Received 25 November 2010; accepted 15 March 2011）