碳納米管修飾電極分子印跡傳感器快速測(cè)定沙丁胺醇

摘要 以單壁碳納米管（SWNTs）為電極材料，應(yīng)用分子印跡技術(shù)，以鄰苯二胺為功能單體、沙丁胺醇為模板，采用電化學(xué)聚合法制備了一種新型的快速檢測(cè)沙丁胺醇分子印跡傳感器，并運(yùn)用電化學(xué)方法去除模板。在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，利用線性溶出伏安法對(duì)印跡和非印跡膜的性能進(jìn)行了比較，對(duì)分子印跡膜的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明，本傳感器檢測(cè)沙丁胺醇具有很高的靈敏性和特異性，檢測(cè)線性范圍為7.94×10^－8～1.36×10^－5 mol/L，檢出限為6.08×10^－8 mol/L。此傳感器只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單處理即可用于豬肉中沙丁胺醇的測(cè)定，加標(biāo)回收率為92.1%～113%。

關(guān)鍵詞 分子印跡膜；電化學(xué)聚合；鄰苯二胺；沙丁胺醇

2010-11-04收稿；2010-12-30接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 20977042）資助項(xiàng)目

E-mail: qsong@jiangnan.edu.cn

1 引 言

沙丁胺醇（Sal，結(jié)構(gòu)式為HOHOOHNH），是人工合成的β-腎上腺素受體興奮劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，使動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分由脂肪組織向肌肉組織轉(zhuǎn)化。但β-受體興奮劑會(huì)在動(dòng)物組織中殘留，可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響身體健康。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)沙丁胺醇的方法十分必要。目前，檢測(cè)沙丁胺醇的方法主要有高效液相色譜法^［1］、液相色譜-質(zhì)譜法^［2］、氣相色譜-質(zhì)譜法^［3］、酶聯(lián)免疫法^［4］和電化學(xué)方法^［5～8］等。其中，電化學(xué)方法因儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快而備受關(guān)注。但是電化學(xué)測(cè)定的靈敏度取決于測(cè)定對(duì)象在電極上的響應(yīng)。沙丁胺醇在裸金電極和玻碳電極上的響應(yīng)比較弱，分析靈敏度不高。采用新型碳納米材料，如多壁碳納米管和C₆₀ 等，對(duì)電極進(jìn)行修飾，可顯著提高檢測(cè)靈敏度^［4，8］。但是這種修飾電極選擇性仍不理想，尚不能用于復(fù)雜樣品的分析。分子印跡膜具有很強(qiáng)的選擇性，可以彌補(bǔ)此點(diǎn)^［9～12］。尤其是采用電聚合法，可在電極表面制備穩(wěn)定高效且具有優(yōu)異選擇性的薄層分子印跡膜^［13］，克服了懸涂法等傳統(tǒng)方法存在的膜比較厚、傳質(zhì)和電荷傳遞速率慢、響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和可逆性差等缺點(diǎn)^{［14，15］}。

本研究以鄰苯二胺為單體、沙丁胺醇為模板，在單壁碳納米管修飾的玻碳電極（GCE）表面通過(guò)電聚合的方法制備分子印跡膜，并運(yùn)用電化學(xué)方法對(duì)模板加以去除，成功研制了一種性能優(yōu)良的分子印跡傳感器。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

IM6電化學(xué)工作站（德國(guó)Zahner公司）；工作電極為直徑為2 mm的玻碳（GC）電極，鉑絲為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。

沙丁胺醇（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；鹽酸克倫特羅、三氯生（Alfa Aesar公司）；鄰苯二胺（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；單壁碳納米管（SWNTs，批號(hào)P027，Carbon Nanotechnologies. Inc. TX）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 玻碳電極的預(yù)處理 將玻碳電極依次用0.5和0.05 μm的Al₂O₃懸濁液在麂皮上拋光后，分別于無(wú)水乙醇和超純水中超聲清洗3 min。將電極置于5 mmol/L K₃Fe（CN）₆溶液中掃描，直到得到合適的循環(huán)伏安曲線（氧化峰與還原峰高之比約為1，峰電位差小于80 mV）為止。

2.2.2 修飾電極的制備 將0.6 mg SWNTs加入2 mL十二烷基硫酸鈉（SDS， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）溶液中，超聲分散30 min，得到0.3 g/L淺黑色SWNTs-SDS懸浮液。取500 μL分散液用200 mL超純水稀釋?zhuān)瑴p壓過(guò)濾到纖維素濾膜上，充分水洗后室溫晾干，得到單壁碳納米管-纖維素復(fù)合膜（SWNTs-MCE）。剪一小塊纖維素膜，將SWNTs-MCE的SWNTs側(cè)用少量水粘在玻碳電極表面，置于濾紙上， 用力按壓后放入丙酮溶液中浸泡3 min，取出晾干，即得到SWNTs/GC電極。

以SWNTs/GC電極為工作電極，以含6 mmol/L鄰苯二胺和0.02 mol/L沙丁胺醇的乙酸緩沖溶液（pH 5.3）為聚合底液，在掃描速度為50 mV/s、電位范圍為0～0.8 V時(shí)，循環(huán)掃描聚合20圈即得到嵌有沙丁胺醇的聚鄰苯二胺（POPD）單壁碳納米管玻碳電極（Sal/POPD/SWNTs/GC）。將此電極置于0.05 mol/L PBS中，以50 mV/s的掃描速度，在0～2.0 V循環(huán)伏安掃描4圈，即可除去聚合膜中的沙丁胺醇，得到沙丁胺醇印跡的鄰苯二胺單壁碳納米管玻碳電極（MIP/POPD/SWNTs/GC）。以裸玻碳電極為工作電極，用同樣的方法修飾，可得到沙丁胺醇印跡的聚鄰苯二胺玻碳電極（MIP/POPD/GC）。非印跡膜（不含沙丁胺醇的聚鄰苯二胺膜）電極（NIP/POPD/SWNTs/GC）的制備除不加模板分子沙丁胺醇外，其余步驟與MIP/POPD/SWNTs/GC電極的制備完全相同。電極用完后，置于PBS中，在0～1.0 V 掃描3～5圈，室溫晾干后即可重復(fù)使用。

3 結(jié)果與討論

3.1 鄰苯二胺在電極表面的電聚合

以沙丁胺醇為模板，鄰苯二胺在不同電極上的聚合曲線見(jiàn)圖1。其中，圖1a為鄰苯二胺在裸玻碳電極上的電聚合曲線；圖1b為鄰苯二胺在SWNTs修飾玻碳電極上的電聚合曲線。由圖1a可知，鄰苯二胺在裸玻碳電極上的電聚合是完全不可逆過(guò)程。隨著掃描圈數(shù)的增多，鄰苯二胺在電極表面逐漸形成不導(dǎo)電的聚合膜，使電流響應(yīng)逐漸變?nèi)酢D1b表明，鄰苯二胺在碳納米管修飾電極上具有更高的初始峰電流，表明SWNTs增加了電極的反應(yīng)位點(diǎn)^［16］，對(duì)鄰苯二胺的氧化具有增敏作用，但隨著掃描圈數(shù)增多，鄰苯二胺也在碳納米管表面形成不導(dǎo)電致密聚合膜，導(dǎo)致電流響應(yīng)逐漸變?nèi)酢?/p>

3.2 修飾電極的性能

圖2為不同電極在K₃Fe（CN）₆溶液中的循環(huán)伏安曲線。將制備好的Sal/POPD/SWNTs/GC電極置于K₃Fe（CN）₆溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，幾乎無(wú)電流響應(yīng)（曲線1），表明電極表面被致密的不導(dǎo)電聚合膜覆蓋。將聚合物膜中的沙丁胺醇去除后，膜表面留下孔穴，離子得以到達(dá)電極表面進(jìn)行電子傳遞，因此將去除模板的MIP/POPD/GC電極（曲線2）和MIP/POPD/SWNTs/GC電極（曲線3）于K₃Fe（CN）₆溶液中掃描時(shí)都出現(xiàn)了氧化還原峰。由于SWNTs特殊的理化性質(zhì)，加大了電極表面的反應(yīng)位點(diǎn)，增加了電極的有效反應(yīng)面積，因此MIP/POPD/SWNTs/GC電極在K₃Fe（CN）₆溶液中的電流響應(yīng)（曲線3）與MIP/POPD/GC電極（曲線2）相比顯著提高。

3.3 去除模板分子

文獻(xiàn)中常用甲醇、乙醇或酸堿溶液等為洗脫液浸泡電極， 以去除模板^［9～12］。本實(shí)驗(yàn)先運(yùn)用上述方法對(duì)傳感器進(jìn)行了清洗，去除效果均不理想。本研究采用電化學(xué)方法去除模板，以提高洗脫效率。具體方法為：將電極置于0.05 mol/L PBS溶液中，以50 mV/s的掃描速度，在0～2.0 V 循環(huán)伏安掃描數(shù)圈后于K₃Fe（CN）₆溶液中循環(huán)伏安掃描，觀察K₃Fe（CN）₆峰電流的變化。結(jié)果顯示，K₃Fe（CN）₆峰電流隨掃描圈數(shù)逐漸增大，表明沙丁胺醇模板被逐漸去除。當(dāng)掃描4圈后，峰電流不再增大，表明沙丁胺醇已被去除干凈。

3.4 沙丁胺醇在不同電極上的伏安響應(yīng)

以裸電極、SWNTs/GC電極、MIP/POPD/SWNTs/GC電極和MIP/POPD/GC電極為工作電極，用線性溶出伏安法（LSVs）測(cè)定8 μmol/L沙丁胺醇溶液，結(jié)果如圖3所示。裸電極對(duì)沙丁胺醇幾乎無(wú)響應(yīng)，只在0.72 V處出現(xiàn)一個(gè)極小的氧化峰（曲線1）。以MIP/POPD/GC電極為工作電極時(shí)，響應(yīng)曲線如曲線2所示，電流響應(yīng)有微弱增強(qiáng)，表明沙丁胺醇在分子印跡膜的孔穴中有少量富集，但由于裸電極對(duì)其無(wú)明顯響應(yīng)，因此，響應(yīng)仍然不高。曲線3為SWNTs/GC電極對(duì)沙丁胺醇的響應(yīng)，由于SWNTs良好的電化學(xué)性質(zhì)，增強(qiáng)了沙丁胺醇分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移速度，電極響應(yīng)明顯增強(qiáng)。而當(dāng)電極表面修飾SWNTs后再電聚合印跡層時(shí)，沙丁胺醇在印跡孔穴中富集，加上SWNTs的增敏效應(yīng)，導(dǎo)致沙丁胺醇在MIP/POPD/SWNTs/GC電極上的峰電流相對(duì)于其它電極明顯增大（曲線4）， 且氧化峰電位負(fù)移至0.68 V。因此，MIP/POPD/SWNTs/GC電極能顯著增強(qiáng)沙丁胺醇的檢測(cè)靈敏度。

3.5 電化學(xué)測(cè)定條件的優(yōu)化

3.5.1 富集電位和富集時(shí)間 富集電位和富集時(shí)間對(duì)氧化峰電流均有影響。在不同的電位進(jìn)行富集，峰電流不變，說(shuō)明沙丁胺醇的測(cè)定不受富集電位的影響，所以選擇開(kāi)路富集。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在10～180 s范圍內(nèi)，峰電流隨富集時(shí)間增長(zhǎng)而增大；當(dāng)富集時(shí)間大于180 s后，峰電流保持不變。說(shuō)明開(kāi)始時(shí)，沙丁胺醇在分子印跡的孔穴內(nèi)進(jìn)行富集和吸附，一段時(shí)間后，富集達(dá)到飽和狀態(tài)。所以選擇富集時(shí)間為180 s進(jìn)行測(cè)定。

3.5.2 pH值 配制不同pH值的PBS溶液，利用循環(huán)伏安法研究pH值對(duì)峰電流的影響。研究發(fā)現(xiàn)，峰電位隨pH值增加而負(fù)移，其線性關(guān)系為E（V）＝1.1496－0.0663pH，r＝0.9976，斜率為66 mV/pH，表明該氧化反應(yīng)中電子和質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)相等^［6，7］。氧化峰值隨pH值的變大而先增大后降低，在pH 7.0處達(dá)到最大。本實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0 PBS緩沖溶液。

3.5.3 掃描速率 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用線性溶出伏安法，在掃速為30～300 mV/s范圍內(nèi)，沙丁胺醇峰電流（i_pa）與掃描速率的平方根（v^1/2）成正比，線性方程為i_pa＝2.2795v^1/2－6.1325，r＝0.9969，表明沙丁胺醇在該電極上的電化學(xué)氧化受擴(kuò)散控制^［6，7］。另外，峰電位隨掃速增加而增大。提高掃速，氧化峰電位正移，不利于氧化反應(yīng)，且充電電流也隨之增大。為獲得較大的峰電流，又防止充電電流過(guò)大，掃描速率選擇為100 mV/s。

3.6 線性范圍及重現(xiàn)性

在上述條件下測(cè)定沙丁胺醇溶液，其濃度與峰電流在7.94×10^－8～1.36×10^－5 mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為：I_pa（μA）＝1.085c（μmol/L）＋3.2075，r＝0.9966（圖4），檢出限為6.08×10^－8 mol/L （S/N＝3），低于只用碳納米管或C₆₀修飾的電極^［6，8］。平行測(cè)定8個(gè)8 μmol/L沙丁胺醇溶液，響應(yīng)值的RSD＝1.64%，重現(xiàn)性良好。將使用過(guò)的電極置于PBS溶液中掃描洗脫后使用，連續(xù)20次，峰值保持不變。用同樣方法制得5根電極，平行測(cè)定誤差在1%～5%之間。電極洗凈晾干，一個(gè)月后測(cè)定同樣濃度的沙丁胺醇溶液，峰值降為原來(lái)的84%，表明該電極穩(wěn)定性良好。

3.7 印跡膜的選擇性

本實(shí)驗(yàn)選擇三氯生、鹽酸克倫特羅、2，4-二氯酚、鄰苯二酚、間苯二酚等與沙丁胺醇有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)以及尿液中含量較高的尿素來(lái)考察傳感器的選擇性。在1 μmol/L沙丁胺醇溶液中加入適量干擾物質(zhì)，用本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的傳感器進(jìn)行檢測(cè)（表1）。實(shí)驗(yàn)表明，以上5種物質(zhì)對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)基本無(wú)干擾。另外，大量尿素的存在對(duì)檢測(cè)也不產(chǎn)生干擾，為本法應(yīng)用于尿液檢測(cè)提供了可能。

表1 干擾物質(zhì)對(duì)1 μmol/L沙丁胺醇檢測(cè)結(jié)果的影響

Table 1 Effect of interference species on determination of 1 μmol/L salbutamol

3.8 樣品分析

將新鮮豬肉攪碎放入冰箱中備用。稱(chēng)取1 g豬肉樣品和適量沙丁胺醇于燒杯中，加入5 mL甲醇，

表2 豬肉樣品的加標(biāo)回收率

Table 2 Recovery data obtained for salbutamol at samples

prepared in 0.05 mol/LPBS at pH 7.0 using a MIP/POPD/SWNTs/GC electrode

超聲30 min，過(guò)濾。將濾液置于離心管中，以3000 r/min離心10 min，取100 μL上清液，用水容至25 mL。用制備的傳感器在上述條件下測(cè)定樣品，結(jié)果如表2所示，回收率在92.1%～113%之間。結(jié)果表明，本傳感器結(jié)合了碳納米材料和分子印跡技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，靈敏度高，選擇性好，將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析，結(jié)果滿意。

References

1 Alejandra H， Carlos F， Marcela P，Viviana D， Sara P. J. Pharm. Biomed Anal.， 2004， 34（1）： 45～51

2 GUO De-Hua， DENG Xiao-Jun， LI Bo， WANG Min， YANG Hui-Qin， HAN Li， CHEN Shun-Sheng（郭德華，鄧曉軍，李 波，王 敏，楊惠琴，韓 麗，陳舜勝）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2008， 36（9）: 1121～1127

3 WU Yin-Liang， LIU Su-Ying， LIU Yong-Jun，SHEN Jian-Zhong，WANG Hai，SHAN Ji-Hao （吳銀良， 劉素英， 劉勇軍， 沈建忠， 王 海， 單吉浩）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2006， 34（Suppl.）: S23～S26

4 Shi Y S， Yi C L， Yung T T， Tong H C， Tzong F K. Anal. Chim. Acta， 2009， 654（2）：148～153

5 Sebastian G， Dimitrios K K， Rashid O K， Craig E. B. Electrochim. Acta， 2008， 53（20）：5885～5890

6 Rajendra N G， Davinder K， Sudhanshu P S， Ashish P. Talanta， 2008， 75（1）: 63～69

7 Rajendra N G， Munetaka O， Sudhanshu P S. J. Electroanal. Chem.， 2007， 611（1-2）: 140～148

8 WU Yun，CHEN Chang-Yun，ZHAO Bo，WANG Zheng-Wu（吳蕓， 陳昌云， 趙 波， 王正武）. Food Sci. （食品科學(xué)）， 2009， 30（19）: 40～43

9 Zhang Z， Hu Y， Zhang H， Yao S. J. Colloid Interface Sci， 2010， 334（1）：158～164

10 Amit K P， Piyush S S， Bhim B P.Int. J. Pharm， 2009， 371（1-2）: 47～55

11 Wayne C， Patrick D， Peter M.Anal. Chim. Acta， 2005， 542（1）: 52～60

12 Joong K P， Hamayun K， Jeong W L. Enzyme Microb. Technol.， 2004， 35 （6-7）: 688～693

13 Sallacan N， Zayats M， Bourenko T. Anal. Chem.， 2002， 74（3）： 702～712

14 ZHAO Jun， LI Jian-Ping， JIANG Fu-Yang（趙 鈞， 李建平， 蔣復(fù)陽(yáng)）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2009， 37（8）: 1219～1222

15 Lahav M， Kharitonov A B， Katz O. Anal. Chem.， 2001， 73（3）：720～723

16 XIANG Dong-Ya， SU Zhen， ZHAO Zhuo， YANG Liu-Quan， YANG Quan-Hong（向東亞， 蘇 珍， 趙 琢， 楊鎏佺， 楊全紅）. New Carbon Meterials（新型炭材料）， 2009， 24（2）：183～186

A Salbutamol Sensor Based on Carbon Nanotubes Modified Electrode and Molecularly Imprinted Polymers

QI Yu-Bing， LIU Ying， SONG Qi-Jun^*

（School of Chemical and Material Engineering， Jiangnan University， Wuxi 214122）

Abstract A novel amperometric sensor based on electropolymerized molecularly imprinted polymer（MIP） for salbutamol detection is reported. The poly（o-phenylenediamine）（POPD） film was prepared by the cyclic voltammetric deposition of o-phenylenediamine（OPD） with and without a template molecule， salbutamol， on the single-walled carbon nanotubes（SWNTs） modified electrodes. Template can be quickly removed by electrochemical method. The performance of the imprinted and non-imprinted（NIP） films was evaluated by liner sweep voltammetry（LSV） in the presence of a supporting electrolyte. A linear amperometric response of salbutamol was obtained within the concentration range of 7.94×10^－8－1.36×10^－5 mol/L with a detection limit of 6.08×10^－8 mol/L. The sensor was successfully applied to the determination of salbutamol in pork meat with a recovery rates between 92.1%－113%.

Keywords Molecularly imprinted polymers; Electropolymerization; o-phenylenediamine; Salbutamol

（Received 4 November 2010; accepted 30 December 2010）