基于銀納米粒子構(gòu)建熒光傳感平臺用于核酸檢測

摘要 報道了基于銀納米粒子構(gòu)建的熒光傳感平臺，并用于核酸檢測。此熒光傳感平臺對核酸檢測基于以下策略：首先，熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA探針被吸附到銀納米粒子的表面，熒光團(tuán)與銀納米粒子近距離接觸，發(fā)生熒光猝滅；加入與探針DNA序列互補的目標(biāo)DNA，兩者雜交形成雙鏈DNA，并從銀納米粒子的表面脫離，熒光得到恢復(fù)。這種銀納米粒子構(gòu)建的熒光傳感平臺對于完全互補和堿基錯配的DNA序列具有良好的區(qū)分能力。

關(guān)鍵詞 核酸檢測；熒光傳感平臺；銀納米粒子

2011-02-25收稿；2011-03-21接受

本文系中國國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 （No.2011CB935800） 資助

E-mail: sunxp@ciac.jl.cn

1 引言

研究者已發(fā)現(xiàn)，人類的許多遺傳疾病都與DNA 分子中堿基序列的突變有關(guān)。發(fā)展迅速、有效、靈敏及低成本的核酸檢測方法對于研究基因的表達(dá)、臨床疾病的診斷和治療都具有重要意義^［1］。隨著納米材料研究的發(fā)展，其在生物技術(shù)體系診斷方面的應(yīng)用備受關(guān)注^［2～4］。將納米材料引入熒光核酸檢測主要是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移或猝滅機理^［5］。納米材料在檢測體系中起納米猝滅劑的作用，并且，同種納米材料具有同時猝滅不同發(fā)射波長的多種染料的能力。納米材料猝滅劑的這種優(yōu)勢消除了以往檢測方法中需要挑選熒光團(tuán)-猝滅劑對的麻煩。目前，已成功用于檢測熒光核酸的納米材料有金納米粒子^［5～9］、單壁碳納米管^{［10，11］}、多壁碳納米管^［12］、碳納米粒子^［13］、碳納米球^［14］、納米C₆₀^［15］、介孔碳微粒^［16］、氧化石墨烯^{［17～19］}、聚苯胺納米纖維^［20］、聚鄰苯二胺膠體球^［21］、2，3-二萘胺微米球^［22］、聚對苯二胺納米帶^［23］、銀@聚間苯二胺核-殼納米粒子^［24］、7，7，8，8-四氰基對苯二醌二甲烷納米粒子^［25］、配位聚合物膠體球^［26］和納米帶^［27］等。盡管如此，繼續(xù)發(fā)展新材料的納米結(jié)構(gòu)來構(gòu)建熒光檢測平臺， 以提高熒光核酸檢測的選擇性和靈敏度等仍然很有必要。

本研究采用銀納米粒子構(gòu)建了熒光傳感平臺，并用于核酸檢測，其選擇性很高，可實現(xiàn)對完全互補和單堿基錯配DNA序列的區(qū)分。本方法是基于圖解1所示的設(shè)計策略：熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA探針被吸附到銀納米粒子的表面引起熒光猝滅，之后與目標(biāo)DNA雜交得到雙鏈DNA，其從銀納米粒子的表面脫離使得熒光得到恢復(fù)。這種設(shè)計主要是基于單雙鏈DNA在銀納米粒子表面不同的吸附能力^{［28，29］}。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑H-8100型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），加速電壓為200 kV

RF-5301PC熒光分光光度計（日本Shimadzu公司）。寡核苷酸（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），通過測量260 nm的紫外吸收值標(biāo)定所用DNA的濃度。其它試劑均購自上海阿拉丁有限公司。實驗用水經(jīng)由Milli-Q高純水處理系統(tǒng)純化。本實驗所采用的DNA 序列如下（錯配位置由下劃線標(biāo)出）：P_HIV （熒光素FAM染料標(biāo)記的作為探針的單鏈DNA）: 5′-FAM-AGT CAG TGT GGA AAA TCT CTA GC-3′；T₁ （互補的目標(biāo)DNA）:5′-GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3′；T₂ （單堿基錯配的目標(biāo)DNA）:5′-GCT AGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3′；T₃ （兩個堿基錯配的目標(biāo)DNA）:5′-GCT AGA GAT TGT ACA CAC TGA CT-3′。

2.2 銀納米粒子的制備AgNO₃和檸檬酸鈉在90 ℃加熱30 min，得到黃色膠體溶液，待進(jìn)一步的表征和應(yīng)用。

3 結(jié)果與討論

3.1 銀納米粒子的電鏡表征

產(chǎn)物銀納米粒子的透射電鏡照片（圖1）顯示，粒徑為50～100 nm。

3.2 銀納米粒子的熒光光譜

應(yīng)用所制備的銀納米粒子（AgNPs）構(gòu)建熒光傳感平臺檢測核酸，并采用與人類免疫缺陷病毒（HIV）相關(guān)聯(lián)的DNA序列構(gòu)建模型體系。圖2顯示的是熒光團(tuán)FAM標(biāo)記的單鏈DNA探針（P_HIV）在不同條件下的熒光發(fā)射譜。當(dāng)體系中不存在銀納米粒子時，由于熒光素染料的修飾，探針DNA展示了很強的熒光發(fā)射；檢測體系加入銀納米粒子30 min時，48%的熒光發(fā)生猝滅，這表明銀納米粒子可以有效吸附單鏈DNA，并猝滅其熒光。相反，當(dāng)加入同探針DNA互補的目標(biāo)DNA （T₁）時，探針DNA與銀納米粒子的復(fù)合物的熒光明顯增強，熒光恢復(fù)達(dá)到88%。需要說明的是，當(dāng)僅有目標(biāo)T₁和探針DNA，而無納米粒子存在時，探針DNA的熒光強度幾乎沒有變化。如圖3所示，當(dāng)向檢測體系中加入5 nmol/L T₁時，可觀察到明顯的熒光恢復(fù)，此檢測平臺的檢出限可低至5 nmol/L。

通過采集隨時間變化的熒光發(fā)射譜，研究檢測過程中的動力學(xué)過程。銀納米粒子存在時， 探針DNA（P_HIV）隨時間變化的熒光猝滅情況，見圖4a。在最初的1 min，熒光強度迅速降低；在隨后的29 min， 熒光強度緩慢降低，直至達(dá)到平衡。圖4b 給出了加入目標(biāo)T₁后熒光的恢復(fù)過程。在最初的1 min，熒光強度迅速增強，隨后趨于平緩， 直至15 min后達(dá)到平衡。

3.3 對堿基錯配的區(qū)分

這種熒光傳感平臺對于完全互補和堿基錯配的DNA序列具有很好的區(qū)分能力。如圖5所示，當(dāng)分別加入完全互補的目標(biāo)T₁、單堿基錯配的目標(biāo)T₂和2個堿基錯配的目標(biāo)T₃ 至檢測體系時，觀察不同的熒光恢復(fù)情況。采用熒光強度的比值F/F₀（F₀ 和F 分別是檢測目標(biāo)加入前后的熒光強度）分析熒光恢復(fù)的差異。其中，單堿基錯配的目標(biāo)T₂所引起的熒光恢復(fù)是T₁的83%，而2個堿基錯配的目標(biāo)T₃所引起的熒光恢復(fù)僅為T₁的60%。圖5的插圖為對應(yīng)的柱狀圖和誤差棒。以上結(jié)果表明，此熒光傳感平臺在進(jìn)行單堿基錯配區(qū)分方面有很好的應(yīng)用前景。

銀納米粒子的用量對于檢測過程中熒光的猝滅和恢復(fù)都有很大影響。圖6為銀納米粒子不同用量（0， 50， 100， 150， 200， 250和300 SymbolmA@ L）時熒光強度的柱狀圖，銀納米粒子用量的增加有利于熒光猝滅效率的增大，但不利于熒光的恢復(fù)。其原因如下：大量銀納米粒子有利于更多的單鏈DNA在其粒子表面的吸附，因而有利于熒光猝滅；過量的銀納米粒子引入到檢測體系中，將有過多的表面空位吸附目標(biāo)DNA分子，阻止其同探針DNA的雜交，不利于熒光的恢復(fù)。本研究的銀納米粒子的用量選擇為200 SymbolmA@ L。

4 結(jié) 論

本研究證明了銀納米粒子可以構(gòu)建一個有效的熒光傳感平臺進(jìn)行熒光增強的核酸檢測，且這種傳感平臺可以很好地區(qū)分完全互補和錯配的DNA序列。本研究工作擴展了銀納米粒子在核酸檢測方面的應(yīng)用，也有望進(jìn)一步實現(xiàn)其它目標(biāo)分子的高靈敏度、高選擇性的熒光檢測。

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Silver Nanoparticles as a FluorescentSensing Platform for Nucleic Acid Detection

ZHANG Ying-Wei¹， LI Hai-Long^1，2， SUN Xu-Ping^*1

¹（State Key Lab of Electroanalytical Chemistry， Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022）

²（Graduate School of the Chinese Academy of Sciences， Beijing 100039）

Abstract In this study， we reported Ag nanoparticles （AgNPs） as an effective fluorescent sensing platform for nucleic acid detection for the first time. The general concept used in this approach is based on adsorption of the fluorescently labeled single-stranded DNA （ssDNA） probe by AgNP， which is accompanied by substantial fluorescence quenching due to their close proximity， followed by specific hybridization with its target to form a double-stranded DNA （dsDNA）. The use of this sensing platform to differentiate complementary and mismatched sequences is also demonstrated.

Keywords Nucleic acid detection；Fluorescent sensing platform；Silver nanoparticles

（Received 25 February 2011accepted 21 March 2011）