高靈敏\\易更新的土霉素分子印跡碳糊傳感器的研制〖

摘要 通過(guò)將土霉素（OTC）分子印跡聚合物顆粒與碳糊混合，制成OTC分子印跡固體石蠟碳糊傳感器（OTC-MICPS）。在分子印跡膜（MIP）上，OTC與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的OTC（HRP-OTC）之間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)，標(biāo)記的HRP可催化H₂O₂氧化對(duì)苯二酚生成對(duì)苯二醌，通過(guò)測(cè)量對(duì)苯二醌的還原電流間接測(cè)定OTC。對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，響應(yīng)電流與OTC濃度（0.008～0.6 SymbolmA@ mol/L）的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，檢出限為1.8 nmol/L。此傳感器可以通過(guò)簡(jiǎn)單的機(jī)械拋光實(shí)現(xiàn)更新。傳感器制作簡(jiǎn)單，使用方便，價(jià)格低廉，靈敏度高，易于更新。用于牛奶樣品的分析測(cè)定，加標(biāo)回收率為93.8%～96.6%。

關(guān)鍵詞 分子印跡；土霉素；電化學(xué)傳感器

辣根過(guò)氧化物酶；碳糊

2010-11-23收稿；2011-02-08接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No.20665003）和廣西自然科學(xué)基金（No.0728214）資助

E-mail: likianping@263.net

1 引言

近年來(lái)，分子印跡電化學(xué)傳感器（MIECS）的研究備受關(guān)注^［1～5］。其中，分子印跡電流型傳感器的報(bào)道較多，多用于物質(zhì)的直接檢測(cè)^［6，7］，或以小分子電活性物質(zhì)為探針的間接檢測(cè)^［8～10］，以及與其結(jié)構(gòu)相似的電活性物質(zhì)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別進(jìn)行間接檢測(cè)^{［11，12］}。但這些檢測(cè)方法的靈敏度不高。本研究組將酶放大效應(yīng)用于MIECS，提高了分子印跡傳感器檢測(cè)的靈敏度^［13］。目前，構(gòu)建MIECS的主要方法是在電極表面合成分子印跡敏感膜，包括原位聚合膜^［6，14］、自組裝膜^{［15，16］}、電聚合膜^{［17，18］}，溶膠-凝膠膜^{［19，20］}等。但是，常規(guī)的MIECS存在分子印跡敏感膜較難更新，模板分子不易于從分子印跡膜中洗脫等缺點(diǎn)。因此，MIECS敏感膜的易更新性直接關(guān)系到其應(yīng)用。碳糊電極是電化學(xué)分析中較常用的可更新的電極，文獻(xiàn)［11］報(bào)道了利用摻雜分子印跡聚合物顆粒和碳糊混合物制備敏感膜易更新的分子印跡傳感器。本研究以土霉素（OTC）為模板分子，利用分子印跡碳糊體系的易更新性，結(jié)合酶放大效應(yīng)高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)^［13］，研制易更新、高靈敏的新型分子印跡傳感器。OTC是一種廣譜抗生素，作為動(dòng)物藥物和飼料添加劑被廣泛應(yīng)用。但長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)造成OTC在動(dòng)物性食品內(nèi)殘留，進(jìn)而通過(guò)食物鏈，危害人體健康。目前，檢測(cè)牛奶中OTC殘留的主要方法是高效液相色譜法^{［21，22］}，但該法操作復(fù)雜，且成本昂貴。本研究制備了OTC分子印跡固體石蠟碳糊傳感器（OTC-MICPS），利用OTC和標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的OTC（HRP-OTC）之間的競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)，通過(guò)掩蔽、一次孵化、二次孵化過(guò)程對(duì)OTC進(jìn)行間接測(cè)定。此傳感器已用于牛奶樣品中OTC的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑CHI660D電化學(xué)工作站（北京華科普天科技有限公司），三電極系統(tǒng): OTC-MICPS為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對(duì)電極。

甲基丙烯酸 （MAA，廣東西隴化工有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯 （EGDMA，IL）；偶氮二異丁腈 （AIBN，上海四試赫維化工有限公司）；土霉素（OTC，ACROS）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)土霉素 （HRP-OTC，50 mg/L，鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；對(duì)苯二酚和H₂O₂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；固體石蠟（50 ℃ m.p.）；光譜純石墨碳粉（60 SymbolmA@ m，上海碳素廠）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝7.4）；MAA和EGDMA使用前經(jīng)減壓蒸餾提純。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 OTC分子印跡聚合物顆粒（OTC-MIPs）的合成

以O(shè)TC為模板分子，MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，乙醇為溶劑，進(jìn)行自由基引發(fā)聚合。將1 mmol OTC溶于100 mL溶劑中，加入10 mmol MAA，超聲混合30 min，制得預(yù)組裝液；加入40 mmol EGDMA和1 mmol AIBN，超聲混合30 min制得聚合液，并通氮?dú)? min。密封后放入60 ℃恒溫水浴中加熱聚合24 h，其產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎、研磨、篩分（≤60 SymbolmA@ m）制成聚合物顆粒。將該顆粒放進(jìn)甲醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）中洗脫，進(jìn)行UV監(jiān)測(cè)，直至洗脫液中檢測(cè)不到OTC。過(guò)濾、烘干制得OTC-MIPs。非分子印跡聚合物顆粒（NMIPs）的制備除不加模板分子外，其它與OTC-MIPs制備方法相同。

2.3 OTC-MICPS的制作

截取5 cm長(zhǎng)銅棒（Φ 1.5 mm）和3.5 cm玻璃管（Φ 4.0 mm .i d.），將兩端磨平并洗凈，用熔融的石蠟將銅棒和0.5 mm厚的碳片（Φ 4.0 mm）固定在玻璃管中，銅棒一端與碳片的一面接觸良好，在碳片的另一面要留有距離玻璃管頂端1 mm深的孔洞。將碳粉和OTC-MIPs混合均勻，然后加入石蠟，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻成碳糊，裝入1 mm深的孔洞中；冷卻后，除去管外的多余物，在光滑的紙上拋光表面，室溫下放置在干燥的空氣中備用。OTC-MICPS的結(jié)構(gòu)如圖1。同時(shí)用類(lèi)似的方法制作非分子印跡碳糊傳感器（NICPS）。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。將OTC-MICPS浸入OTC（100 SymbolmA@ mol/L）溶液中5 min 掩蔽OTC-MICPS表面的特異性識(shí)別位點(diǎn)，取出傳感器，用水沖洗其表面；在200 SymbolmA@ L HRP-OTC溶液中浸泡15 min，進(jìn)行第一次孵化，使得HRP-OTC可以特異性識(shí)別掩蔽進(jìn)入有OTC分子時(shí)的位點(diǎn)，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)，置換出一部分位于該識(shí)別位點(diǎn)中的OTC，取出傳感器，再用水沖洗其表面；二次孵化分別是在200 SymbolmA@ L的0～1 SymbolmA@ mol/L OTC溶液中進(jìn)行，孵化18 min，使得溶液中的OTC競(jìng)爭(zhēng)取代特異性識(shí)別于傳感器表面的HRP-OTC。取出傳感器，用水沖洗其表面，然后將傳感器放入測(cè)試液中，用循環(huán)伏安法（CV）或差分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。底液為含1 mmol/L 對(duì)苯二酚和5 mmol/L H₂O₂-PBS（pH 7.4），電位掃描范圍分別為0.8～－0.6 V 和0.6～－0.6 V，掃描速率為100 mV/s。所有電化學(xué)測(cè)量均在25 ℃下進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚合物顆粒的紅外光譜分析

圖2中曲線a，b和c分別為非印跡膜nMIPs，印跡膜洗脫OTC前的OTC-MIPs和洗脫OTC后的OTC-MIPs 的紅外光譜圖。與曲線a相比，曲線b中3452 cm^－1處的OH伸縮振動(dòng)峰的紅外強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這屬于OTC中含有的豐富OH；在3747 cm^－1處出現(xiàn)了酚羥基伸縮振動(dòng)峰，這是OTC的特征峰。因此，合成的OTC-MIPs中含有OTC。曲線a和曲線c的峰形和強(qiáng)度基本一致，說(shuō)明OTC能夠從OTC-MIPs中洗脫。

3.2 OTC-MICPS的伏安特征OTC-MICPS能夠特異性識(shí)別OTC和HRP-OTC。二次孵化后，不同濃度的OTC與印跡膜表面的HRP-OTC產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)取代，使傳感器表面的HRP-OTC的量發(fā)生變化。而標(biāo)記的HRP量的改變導(dǎo)致溶液中媒介體對(duì)苯二酚的濃度變化。圖3為OTC-MICPS在HRP-OTC中孵化前（a）后（b）的CV曲線。OTC-MICPS在孵化前，出現(xiàn)了一對(duì)幾乎對(duì)稱(chēng)的準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，該峰為對(duì)苯二酚在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)所致；孵化后，氧化峰強(qiáng)度明顯減小，還原峰強(qiáng)度急劇增大，是典型的HRP催化電流曲線。表明OTC-MICPS能夠識(shí)別HRP-OTC，并將其固定于OTC-MICPS表面，使對(duì)苯二酚能有效地在OTC-MICPS與HRP之間傳輸電子。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證OTC-MICPS的特異性識(shí)別，做以下對(duì)比實(shí)驗(yàn)。圖4分別為OTC-MICPS（A）和NICPS（B）依次在HRP-OTC和未加入OTC的水溶液中孵化后，在1 mmol/L對(duì)苯二酚-PBS（pH 7.4）中加入5 mmol/L H₂O₂前（a）后（b）的DPV曲線。孵化后的OTC-MICPS在加入H₂O₂前后還原峰電流變化非常明顯，而孵化后的NICPS變化并不明顯。這表明OTC-MICPS能夠特異性識(shí)別HRP-OTC，且加入H₂O₂后，此傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異電催化活性。而NICPS不具有特異性識(shí)別位點(diǎn)，HRP-OTC不能特異性的固定于NICPS表面，所以孵化后NICPS電流變化微小，這可能是由于HRP-OTC非特異性吸附于NICPS表面所引起的。在圖4A中，曲線c為OTC-MICPS依次在HRP-OTC和0.1 SymbolmA@ mol/L OTC中孵化后的DPV曲線。比較曲線b與c，OTC能夠與特異性識(shí)別于OTC-MICPS表面的HRP-OTC進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)，從而使識(shí)別于OTC-MICPS表面的HRP-OTC減少，電流降低。這為OTC的定量分析提供了理論基礎(chǔ)。

3.3 OTC-MICPS組成成分的選擇

碳糊的各組成成分（OTC-MIPs、碳粉、石蠟）對(duì)OTC-MICPS的性能有很大影響。石蠟作為固定OTC-MIPs和碳粉的粘合劑，對(duì)OTC-MICPS的穩(wěn)定性有重要作用。石蠟用量越大，OTC-MICPS越穩(wěn)定，但由于石蠟是非導(dǎo)電物質(zhì)，其用量大，會(huì)阻礙電子的傳遞，致使OTC-MICPS的電流響應(yīng)降低。綜合考慮，在保證OTC-MICPS穩(wěn)定的前提下，石蠟的用量應(yīng)為最少。本實(shí)驗(yàn)中石蠟的用量選擇35%。OTC-MIPs作為傳感器的敏感材料，其用量越多，傳感器能提供的特異性識(shí)別位點(diǎn)越多，OTC-MICPS的電流響應(yīng)越明顯。但是，由于OTC-MIPs是非導(dǎo)電性物質(zhì)，當(dāng)用量超過(guò)臨界值，電流響應(yīng)將會(huì)降低。碳粉雖是優(yōu)良的導(dǎo)電性材料，能改善靈敏度，但增加用量會(huì)造成OTC-MIPs比例減少，即特異性識(shí)別位點(diǎn)減少。在石蠟的用量為35%的前提下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)OTC-MIPs和碳粉的比例進(jìn)行優(yōu)化。如表1所示，ΔI為一次孵化后的OTC-MICPS在測(cè)試底液中加入5 mmol/L H₂O₂前后的峰電流差值。當(dāng)OTC-MIPs的用量為15%，碳粉為50%時(shí)，OTC-MICPS的響應(yīng)最明顯。本實(shí)驗(yàn)選擇石蠟的用量為35%，OTC-MIPs用量為15%，碳粉用量為50%。

3.4 底物濃度的選擇H₂O₂作為HRP底物之一，在電子媒介存在時(shí)，HRP與H₂O₂迅速反應(yīng)。H₂O₂既為HRP的底物，也為其抑制劑。為了確定H₂O₂的最佳用量，考察了0～20 mmol/L H₂O₂的PBS（pH 7.4）介質(zhì)對(duì)還原峰電流的影響。隨著H₂O₂濃度增加，還原峰電流逐漸增大；當(dāng)H₂O₂濃度增大到5 mmol/L時(shí)，還原峰電流達(dá)到最大，這可能是由于過(guò)量的H₂O₂與酶結(jié)合成復(fù)合物，從而抑制酶的中間產(chǎn)物對(duì)底物的催化氧化。本實(shí)驗(yàn)中H₂O₂的濃度為5 mmol/L。

對(duì)苯二酚作為HRP的優(yōu)良電子媒介，能快速將電子從電極表面?zhèn)鬟f到酶的氧化還原活性中心。其濃度對(duì)響應(yīng)電流有很大影響。對(duì)苯二酚濃度從0.25 mmol/L增加至1.00 mmol/L，其氧化還原峰電流逐漸增大；對(duì)苯二酚濃度增大到2.50 mmol/L時(shí)，電流無(wú)明顯變化，這是媒介體型傳感器的典型特征。在較低濃度（0.25 mmol/L）的媒介體溶液中，電流響應(yīng)主要由酶-媒介體動(dòng)力學(xué)控制；而高濃度（2.50 mmol/L）的媒介體產(chǎn)生的響應(yīng)由酶-底物動(dòng)力學(xué)控制。因?yàn)楸尘半娏麟S媒介體的濃度增高而增大，本實(shí)驗(yàn)的對(duì)苯二酚濃度選用1.00 mmol/L。

3.5 孵化時(shí)間的選擇

孵化時(shí)間是指HRP-OTC與OTC競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)到平衡所需要的時(shí)間。由于HRP的空間位阻效應(yīng)，使得OTC-MICPS表面的特異性識(shí)別位點(diǎn)不易被HRP-OTC占據(jù)。因此，實(shí)驗(yàn)中采用兩次孵化，以降低OTC的檢出限^［13］。為此，在一次孵化前需進(jìn)行掩蔽。一次孵化實(shí)驗(yàn)在200 SymbolmA@ L HRP-OTC中進(jìn)行，孵化時(shí)間0～30 min，進(jìn)行DPV測(cè)試。從圖5a可見(jiàn)，隨著孵化時(shí)間的增加，電流逐漸增大；孵化15 min時(shí)，電流值達(dá)到穩(wěn)定。說(shuō)明溶液中的HRP-OTC與掩蔽在OTC-MICPS表面的OTC競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)達(dá)到平衡。故一次孵化時(shí)間選取15 min。二次孵化實(shí)驗(yàn)在0.1 SymbolmA@ mol/L OTC中，孵化0～30 min。然后進(jìn)行DPV測(cè)試。從圖5b可見(jiàn)，隨著二次孵化時(shí)間的增長(zhǎng)，電流逐漸降低，這是由于特異性識(shí)別于傳感器表面的HRP-OTC分子逐漸被溶液中的OTC分子競(jìng)爭(zhēng)取代；二次孵化18 min時(shí)，電流值達(dá)到穩(wěn)定，競(jìng)爭(zhēng)取代達(dá)到平衡。當(dāng)二次孵化分別在0.008和1 SymbolmA@ mol/L OTC中進(jìn)行孵化18 min后， 競(jìng)爭(zhēng)取代反應(yīng)依舊可以達(dá)到平衡。所以二次孵化的最優(yōu)時(shí)間為18 min。

讀取峰電流與右基線電流間的差值。OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度越大，所測(cè)得的峰電流越小。這是由于OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度越大，對(duì)特異性識(shí)別于傳感器表面的HRP-OTC分子競(jìng)爭(zhēng)取代能力越強(qiáng)，致使傳感器表面的HRP-OTC分子隨著溶液中OTC分子的增加而減少。所以，由HRP催化底液測(cè)得的峰電流降低。OTC-MICPS在未加入OTC的水溶液中進(jìn)行二次孵化，所測(cè)得的峰電流為I₀；OTC-MICPS分別在0.008～1 SymbolmA@ mol/L OTC中進(jìn)行二次孵化，所測(cè)得的峰電流為I；ΔI＝I₀ － I。ΔI與OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0.008～0.6 SymbolmA@ mol/L）的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。線性回歸方程為ΔI（ SymbolmA@ A）＝ 5.3884 lgC（ SymbolmA@ mol/L）＋15.3615 （r＝0.9976）。傳感器對(duì)OTC的檢出限為1.8 nmol/L（S/N＝3）。

3.7 重現(xiàn)性和選擇性O(shè)TC-MICPS每次使用后可以通過(guò)機(jī)械拋光，除去已經(jīng)特異性識(shí)別了OTC和HRP-OTC分子的傳感器表層，從而達(dá)到更新OTC-MICPS的目的。使用同一支OTC-MICPS，每次更新后對(duì)0.05 SymbolmA@ mol/L OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%（n＝5），制作5支不同的OTC-MICPS，對(duì)上述OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%（n＝5）；制作的OTC-MICPS在室溫下放置超過(guò)2個(gè)月，電極性能沒(méi)有變化。說(shuō)明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

考察了牛奶樣品中可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)OTC-MICPS測(cè)定的影響。在OTC的溶液中分別加入0.2 mol/L乳糖；1×10^－5 mol/L的V_{c， VB1}， V_B2， V_B3和尿素；5×10^－3 mol/L的Ca^2＋， Mg^2＋和Zn^2＋。結(jié)果表明，OTC-MICPS分別在上述溶液中二次孵化后進(jìn)行DPV測(cè)試，響應(yīng)電流與不含干擾物質(zhì)時(shí)基本相同。說(shuō)明此傳感器具有很高的選擇性，在實(shí)際應(yīng)用中能有效抵抗干擾。

與其它方法［13，23，24］制作的OTC分子印跡傳感器比較，OTC-MICPS具有高的靈敏度，并且易于更新重復(fù)使用。

3.8 牛奶樣品加標(biāo)回收分析

測(cè)定前，對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理，除去牛奶樣品中的大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)和脂肪）。取5 mL牛奶樣品至離心管中，加入10 mL乙腈，劇烈振蕩1 min，于4 ℃，以15000 r/min離心5 min。去除上清液表層的脂肪，收集上清液。用PBS將上清液稀釋10倍，進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做牛奶樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，回收率為93.8%～96.6%。表明此傳感器對(duì)實(shí)際樣品中OTC的分析測(cè)定性能優(yōu)良。

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A Strategy for Constructing Sensitive and Renewable MolecularImprinted Carbon Paste Sensor

CHEN Zhi-Qiang， LI Jian-Ping^*， LI Yu-Ping

（College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541004）Abstract Oxytetracycline （OTC） molecular imprinted particles and carbon paste were mixed to prepare OTC molecular imprinted carbon paste sensor. The sensor could specifically recognize OTC and horseradish peroxidase （HRP） labeled OTC by the competition replacement reaction between them. The labeled HRP catalyzed the reaction between H₂O₂ and mediator hydroquinone， and the detection of OTC was based on the voltammetric monitoring of the electroreduction of the oxidized mediator， benzoquinone. A linear relationship between response current and logarithm of concentrations of OTC in the concentration range of 0.008－0.6 SymbolmA@ mol/L was obtained with a detection limit of 1.8 nmol/L. The sensor renewal was achieved by a simple mechanical polishing step of sensors′surface. The sensor is easy to prepare and use， low cost， high sensitivity and easy renewal. The sensor has been successfully applied to the determination of OTC in milk samples. The recoveries were 93.8%－96.6%.

Keywords Molecular imprinted；Oxytetracycline；Electrochemical sensor；Horseradish peroxidase；Carbon paste

（Received 23 November 2010accepted 8 February 2011）