基于丙酮酸/還原型輔酶I/乳酸脫氫酶/氧化型輔酶I/乳酸正逆反應同時測定丙酮酸/乳酸的酶熒光毛細管分析

摘要 利用丙酮酸（PA）/還原型輔酶I（NADH）/乳酸脫氫酶（LDH）/氧化型輔酶I（NAD^＋）/乳酸（LA）熒光反應體系的正逆反應，建立了一種可直接用于臨床檢驗、能同時測定血清中微量PA/LA的酶熒光毛細管分析法。本方法可在常規(guī)熒光光度計上，用普通玻璃毛細管同時實現(xiàn)了PA/LA的高靈敏分析，每次分析試劑和樣品的用量僅9 μL，而且方法重現(xiàn)性好，血清樣品預處理操作簡單。得到的最佳條件：60 μmol/L NADH，100 U/L LDH，3 mmol/L NAD^＋，測定乳酸的pH值為9.0、丙酮酸的pH值為7.5，反應時間10 min； LA的線性范圍是0.05～1.0 mmol/L； 檢出限為0.023 mmol/L； RSD＜1.6%；PA的線性范圍是4～80 μmol/L； 檢出限為0.73 μmol/L； RSD＜1.3%；血清中PA和LA的添加回收率在94%～105%之間；測定結(jié)果與常規(guī)紫外分光光度法一致。

關(guān)鍵詞 熒光毛細分析；丙酮酸； 乳酸； 乳酸脫氫酶； 血清

2010-10-20收稿; 2011-01-12 接受

本文系四川大學214振興計劃基金項目（No.0082204127098）資助

Email: li-yongsheng@scu.edu.cn; lysgxf2005@yahoo.com.cn

1 引 言

乳酸（Lactic acid，LA）是人體內(nèi)無氧酵解的最終產(chǎn)物，人體所有組織都可產(chǎn)生。人血清中LA正常值為0.56～2.22 mmol/L。丙酮酸（Pyruvic acid，PA）是糖酵解過程的最終產(chǎn)物以及糖類、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的中間產(chǎn)物^［1］，它可以通過三酸循環(huán)進行有氧代謝或被還原為乳酸^［2］。人血清PA正常值為40～100 μmol/L。在嚴重急性組織缺氧、急性肝臟或腎衰竭等情況下，臨床診斷采用血清中LA與PA的比值，比采用各自濃度更可靠^［3］。人體血清中LA與PA比值正常范圍為10～20，當其比值＞30時則認為超標。因此，同時測定血清中的LA和PA尤為重要。

目前，測定血清中PA和LA的方法已有報道。Olsen^［4］采用酶催化-熒光法測定了血液中LA和PA；Hallstrom等^［5］用高效液相色譜-紫外法對血液及組織中的LA和PA進行測定； Chen等^［6］采用離子交換色譜測定了血清中PA和LA； Xue等^［7］采用毛細管電泳-熒光法測定了單個紅細胞中LA和PA； Baena等^［8］采用毛細管電泳-紫外法檢測了老鼠血漿中PA和LA； 王海燕等^［9］使用丙酮酸氧化酶法和乳酸氧化酶法測定了血液中PA和LA。

熒光毛細管分析法（FCA）是一種新生的微量測定法^［10］。已報道了該法用于酒中乙醇^［11］、酸奶中LA^［12］、血液中葡萄糖^［13］與DNA^［14］、尿中磺酸化膽汁酸^［15］和PA^［16］等的測定。FCA的特點是采用普通醫(yī)用毛細管和毛細管精密定位座代替常規(guī)熒光池， 使每次測試的反應試劑和試樣的用量降至9 μL，與常規(guī)熒光法相比，測定成本能節(jié)約99.5%，而且大大減少了廢物排放，保護了環(huán)境。本研究將酶催化與熒光毛細管分析法相結(jié)合（P/L-LE-FCA），利用PA/還原型輔酶I（Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid， NADH）/乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase， LDH）/氧化型輔酶I（Nicotinamide-adenine dinucleotid， NAD^＋）/LA熒光反應體系的正逆反應，建立了同時測定微量血清中微量PA和LA的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度儀、AUW120D電子天平（日本島津公司）； 干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）； PXJ-1C^＋離子活度計（成都世紀方舟科技有限公司），毛細管定位座（自制），玻璃毛細管（18 μL，華西醫(yī)科大學儀器廠）。毛細管預處理可參考了文獻［12，16］。

LDH（EC 1.1.1.27， 5000 U/mL， Amersco）、NADH、NAD^＋、丙酮酸鈉（廈門星隆達化學試劑有限公司）； 乳酸（成都科萊實驗有限公司）。所有試劑均為分析純。實驗用水均為超純水（電導率0.065 μS/cm）。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.5），0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（Tris-HCl，pH9.0）。熒光空白液Ⅰ：2 mL 0.24 mmol/L NADH＋2 mL 0.1 mol/L PBS （pH 7.5）；熒光空白液：2 mL 24 mmol/L NAD^＋＋2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）。熒光反應液Ⅰ：2 mL 0.24 mmol/L NADH＋2 mL 400 U/L LDH；熒光反應液Ⅱ：2 mL 24 mmol/L NAD^＋＋2 mL 400 U/L LDH。

2.2 測定方法

2.2.1 定量分析PA 在1.5 mL微量試管中依次加入100 μL熒光反應液I和100 μL PA標準溶液（或血清），混勻，常溫下反應10 min；將此熒光反應混合液吸入玻璃毛細管內(nèi)，用橡膠帽將其一端封住，未封口的一端插入毛細管精密定位座內(nèi)^［11］，在給定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下測定該熒光反應混合液的熒光強度（F）；在另一個1.5 mL微量試管中依次加入100 μL熒光空白液Ⅰ和100 μL PBS緩沖液，測定其熒光強度（F₀），作為空白，以熒光猝滅程度（ΔF＝F₀－F）定量分析PA。

2.2.2 定量分析LA 在1.5mL微量試管中依次加入100 μL熒光反應液Ⅱ和100 μL LA標準溶液（或血清），混勻，常溫下反應10 min，測定其熒光強度（F）；在另一個1.5 mL 微量試管中依次加入100 μL熒光空白液ⅠI和100 μL Tris-HCl緩沖液，測定其熒光強度（F₀）作為空白，根據(jù)熒光增強程度（ΔF′＝F₀－F）定量分析乳酸。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法的測定原理

P/L-LE-FCA的測定原理見反應式（1）。pH＝7.5時，PA在L-LDH的催化作用下與NADH反應，生成無熒光的NAD^＋和LA，NADH的熒光猝滅程度（ΔF）與PA濃度（C_PA）成正比，檢測NADH的熒光猝滅可定量分析PA；pH＝9.0時，上述反應向逆方向進行，即，LA在L-LDH的催化作用下與NAD^＋反應，形成有熒光的產(chǎn)物NADH，其熒光增強程度（ΔF′）與LA的濃度（C_LA）成正比，檢測NADH的熒光強度可定量分析LA。

（1）

3.2 LA/NAD＋/LDH和PA/NADH/LDH反應體系熒光光譜掃描

為了考察LA/NAD^＋/LDH反應體系的熒光光譜，分別對LA， NAD^＋， LDH， LA＋NAD^＋， LA＋LDH， LDH＋NAD^＋及LA＋LDH＋NAD^＋等溶液進行掃描。其中，pH ＝9.0，NAD^＋濃度為3 mmol/L，LDH為50 U/L，LA為0.8 mmol/L。上述各溶液在38 ℃下反應10 min后，在10 nm × 20 nm的光通帶、350 nm的激發(fā)波長條件下進行發(fā)射光譜掃描；在460 nm發(fā)射波長下進行激發(fā)光譜掃描，結(jié)果見圖1a。LA， NAD^＋， LDH， LA＋NAD^＋及LA＋LDH溶液的光譜圖基本重合，在345和460 nm處的熒光強度值較低，LDH＋NAD^＋混合液的熒光強度值略有不同，但都遠低于LA＋LDH＋NAD^＋混合液產(chǎn)生的熒光強度，說明LA的確增強了該反應體系的熒光。所以，可利用熒光增強定量分析LA。

同理，為考察PA/NADH/LDH反應體系的熒光光譜，分別對PA， NADH， LDH， PA＋NADH， PA＋LDH， LDH＋NADH及PA＋LDH＋NADH等溶液進行了掃描。其中，pH＝7.5，NADH濃度為60 μmol/L，LDH為50 U/L，PA為50 μmol/L。其它操作同上，結(jié)果見圖1b。PA， LDH和PA＋LDH混合液的光譜圖基本重合，無最大發(fā)射波長。在345和460 nm處的熒光強度值較低；NADH， PA＋NADH， LDH＋NADH混合液的光譜圖基本重合，熒光強度值最高；但是，PA＋LDH＋NADH溶液產(chǎn)生的熒光強度值低于NADH， PA＋NADH和LDH＋NADH混合液，說明PA的確使反應體系的熒光發(fā)生了猝滅。所以，可利用熒光猝滅程度定量分析PA。

3.3 LA/NAD^＋/LDH熒光反應體系的條件優(yōu)選

3.3.1 LDH濃度的影響 LDH催化LA與NAD^＋的反應，其濃度直接影響該反應的速度。本實驗將NAD^＋濃度固定為3.0 mmol/L，Tris-HCl緩沖液的pH＝9.0，反應溫度38 ℃，反應時間15 min，分別用0.4和1.0 mmol/L LA作為樣品，考察了酶濃度對熒光增強的影響，結(jié)果見圖2a。LDH濃度在0～100 U/L范圍內(nèi)，ΔF隨其濃度增加而增大，在100 U/L時熒光強度出現(xiàn)最大值。本研究的反應液體系中LDH濃度為100 U/L。

3.3.2 NAD^＋濃度的影響 LDH濃度為100 U/L，其它條件同上，結(jié)果見圖2b。NAD^＋濃度在0～3 mmol/L范圍內(nèi)，ΔF隨其濃度增加而增大；當NAD^＋濃度高于3 mmol/L時，ΔF達到一個平臺，不再隨濃度而變化。本研究的反應液體系中NAD^＋濃度選定為3 mmol/L。

3.3.3 pH值的影響 LA/NADH/LDH體系的酸度影響LDH的穩(wěn)定性、LDH-底物復合物以及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶促反應速度。根據(jù)反應方程（1）可知，酸度太大時，不利于生成NADH。用不同pH值的Tris-HCl緩沖液配制反應混合液，分別以0.4和1.0 mmol/L LA為樣品，考察了pH值的影響。由圖2c可見，當pH＝9.0時，ΔF達到最大值。本研究的反應體系的pH值選定為9.0。

3.3.4 反應時間的影響 反應時間是酶促反應的關(guān)鍵因素。本反應體系的反應時間過長，導致分析速度降低；反應時間過短，NADH的生成量不穩(wěn)定，從而影響分析結(jié)果的準確性。考察了熒光反應混合液的反應時間與ΔF的相關(guān)性，結(jié)果見圖2d。在0～10 min，ΔF逐漸增大；10 min后，ΔF趨于穩(wěn)定。本實驗的反應時間選取10 min。

3.4 PA/NADH/LDH熒光反應體系的條件優(yōu)選

當LA/NAD^＋/LDH/PA/NADH體系的pH 9.0變到pH 7.5時，該反應開始向方程（1）的逆方向進行，即PA開始與NADH反應生成無熒光的NAD^＋和LA，利用此原理實現(xiàn)了對LA和PA的同時定量分析。

3.4.1 NADH濃度的影響 測定PA時，NADH濃度直接影響NAD^＋的生成量和PA的測定靈敏度。固定LDH濃度為200 U/L、PBS濃度為0.1 mmol/L （pH 7.5）、反應溫度38 ℃、反應時間 10 min，分別以50和100 μmol/LPA為測試樣品，考察0， 20， 40， 50， 60， 80和100 μmol/L NADH對ΔF′的影響，結(jié)果見圖3a。在0～60 μmol/L范圍內(nèi)，隨著NADH濃度增加，ΔF′逐漸增大；當NADH濃度＞60 μmol/L時，ΔF′趨于穩(wěn)定。本反應體系中的NADH濃度選定為60 μmol/L。

3.4.2 LDH活性濃度的影響 當熒光體系酸度在pH 7.5時，LDH開始逆反應，即對PA與NADH的反應發(fā)揮催化作用。考察了LDH活性濃度對逆反應的熒光猝滅程度的影響（圖3b）。LDH濃度在0～100 U/L范圍內(nèi)，ΔF′與其成正比，在100 U/L時出現(xiàn)最大值，之后不再隨其濃度增加而變化。本反應體系中LDH的活性濃度也選擇為100U/L。由于此濃度與3.3.1節(jié)相同，說明對于LA/NAD^＋/LDH/PA/NADH體系的正逆反應，LDH的催化能力相同。

3.4.3 反應時間的影響 在上述最佳實驗條件下，考察了0， 1， 2， 5， 10， 15和20 min反應時間對PA/NADH/LDH反應體系的影響。從圖3c可見，反應10 min后，熒光反應混合液的ΔF′趨于穩(wěn)定。測定PA時，反應時間也選取10 min。

3.5 干擾實驗

考察了血清中共存物質(zhì)對LA和PA測定的影響。人血清中LA正常值為0.56～2.22 mmol/L，PA正常值為40～100 μmol/L。實驗表明，當LA濃度為0.2 mmol/L、控制其相對誤差＜±5%時，下列物質(zhì)存在（倍數(shù)）不干擾LA的測定：Na^＋， Cl^－（4000），K^＋， 葡萄糖， 尿素（100），Mg^2＋（50），L-酪氨酸、維生素C（10），VB₁、L-谷氨酸（5），蛋白（BSA）（1.5），Cu^2＋（1）， PA（0.1）；當PA濃度為50 μmol/L、控制其相對誤差在±5%范圍內(nèi)，下列物質(zhì)存在（倍數(shù)）不干擾PA的測定: Na^＋， Cl^－（16000），K^＋， 葡萄糖， LA， 尿素（400），Mg^{2＋（200）}，L-酪氨酸， 維生素C， Cu^2＋（20），VB₁， L-谷氨酸（10），BSA（6）。

3.6 樣品預處理方法的考察

由于人血清中含有多種酶類和有熒光性的物質(zhì)，因此，先對血清樣品預處理方法進行了篩選。結(jié)果表明：未處理的血清與NADH混合后，其熒光強度隨時間逐漸衰減，直到15 min后趨于穩(wěn)定；用“血清＋三氯乙酸＋離心分離”方法處理的血清，再與NADH混合后，其熒光強度不再隨時間變化；在75 ℃（10 min）加熱處理的血清與NADH混合后，其熒光值也不再隨時間變化。為了減化操作，本研究采用血清加熱法。

對預處理溫度和時間進行了考察。將同一血清樣品在50～90 ℃范圍內(nèi)分別加熱10 min，與NADH混合，測定其熒光值隨時間的變化趨勢。結(jié)果表明：當溫度低于75 ℃時，已處理的血清樣品與NADH混合后，其熒光仍有猝滅，說明血清中的干擾還未完全除去；當溫度高于75 ℃時，其熒光值趨于穩(wěn)定，說明血清中的干擾已除去。但溫度越高其熒光背景越高（F₀: 860→995）。因此，預處理溫度選擇為75 ℃。

在75 ℃下，將同一血清樣品分別加熱處理0， 5， 10， 15和20 min后，再與NADH混合，測定其熒光值隨時間的變化趨勢。結(jié)果表明：當加熱時間為5 min時，血清樣品與NADH混合后其熒光值已趨于穩(wěn)定，說明血清中的干擾已除去；因此選擇血清樣品的預處理加熱時間為5 min。

3.7 實際血樣測定

3.7.1 樣品的測定 先將血清樣品預稀釋5倍，在75 ℃下加熱處理5 min后，取100 μL與等體積的熒光反應液混合。測定LA時，根據(jù)熒光增強程度（ΔF′＝F－F₀）定量分析血清樣品中LA含量；測定PA時，根據(jù)熒光猝滅程度（ΔF＝F₀－F）定量分析血清樣品中PA含量，測定結(jié)果見表1。

表1 P/L-LE-FCA法測定血清樣品中LA和PA的結(jié)果

Table 1 Determination of lactic acid content in serum samples obtained by micro volume serum fluorescence capillary analysis

（P/L-LE-FCA ）

在預稀釋后的血清樣品中， 分別添加0.3和0.5 mmol/L LA標準溶液，并在75 ℃下加熱處理5 min后，測定了LA的回收率。在血清樣品中分別添加20 和40 μmol/L PA標準溶液，測定了PA的回收率。測定結(jié)果見表2。LA和PA在血清樣品的回收率分別為94%～103%和97%～105%，結(jié)果均令人滿意。

表2 P/L-LE-FCA法測定血清樣品中LA和PA含量的回收率實驗

Table 2 Recovery experiments of determination of lactate and pyruvate contents in serum samples by P/L-LE-FCA

采用常規(guī)的紫外分光光度法^［17］對上述血樣進行測定，發(fā)現(xiàn)兩種方法的結(jié)果無顯著性差異。

3.7.2 重現(xiàn)性和檢出限 在P/L-LE-FCA的線性范圍內(nèi)，分別選用0.2和0.8 mmol/L LA與10和60 μmol/L PA標準溶液進行重現(xiàn)性實驗（n＝11），考察方法的精密度。測定LA得到的兩組ΔF平均值分別為151.7±4.8（RSD＜3.1%）和500.1±8.1（RSD＜1.6%）；測定PA得到的兩組ΔF平均值分別為66.3±1.6（RSD＜2.4%）和403.1±5.1（RSD＜1.3%）。結(jié)果表明，本方法重現(xiàn)性很好。經(jīng)計算，本方法測定LA的檢出限為0.023 mmol/L； PA的檢出限為0.73 μmol/L（C_L＝3S/K）。

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Enzyme Fluorescence Capillary Analysis for Simultaneously Determining

Trace-Level Pyruvate and Lactate Based on Forward and Reverse

Reactions of Pyruvate/NADH/LDH/NAD^＋/Lactate System

LI Yong-Sheng^*1， YANG Wei¹， LI Qiao-Jing¹， ZHOU Lang¹， GAO Xiu-Feng^*2

¹（School of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065）

²（West China School of Preclinical and Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract A new enzyme fluorescence capillary analysis for simultaneous determination of trace-level pyruvate （PA） and lactate （LA） contents in micro-volume serum （P/L-LE-FCA） was proposed by means of forward and reverse reactions of pyruvate/reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid （NADH） /lactate dehydrogenase （LDH）/nicotinamide-adenine dinucleotid （NAD^＋）/lactate system. This method's has realized high-sensitive determination of PA and LA using a common glass capillary and a capillary holder on conventional fluorophotometer， and dosage of reagent and sample was only 9 μL at one-time test， moreover， its reproducibility was better and pretreatment procedure of the serum samples was very simple. The optimum experimental conditions were as follows: the concentrations of NAD^＋ and LDH as well as NADH were 3 mmol/L， 100 U/L and 60 μmol/L， respectively; the pH of buffer solution was 9.0 for LA test and 7.5 for PA test; the reaction time was 10 min. For determination of LA， its linear range was 0.05－1.0 mmol/L and detection limit was 0.023 mmol/L and RSD was ＜1.6% （n＝11）; for the determination of PA its linear range was 4－80 μmol/L and detection limit was 0.73 μmol/L and RSD was ＜1.3% （n＝11）. Recovery of the method was 94%－105%. Results determined by using P/L-LE-FCA and UV method were well coincident each other. The characteristics of our method are that it realized simultaneous determination of trace-level PA/LA at normal fluorophotometer， and its sample′s pretreatment is simple and timesaving， it has higher sensitivity and better reproducibility， and can be directly used for the measurement and research on the LA/PA content in trace sample in the clinical testing.

Keywords Fluorescence capillary analysis; Pyruvate; Lactate; Lactate dehydrogenase; Serum

（Received 20 October 2010; accepted 12 January 2011）