pH值和陰離子對吡啶2,6-二羧酸在金納米顆粒表面的增強拉曼散射的影響

摘要 表面增強拉曼散射（SERS）被用于檢測細菌芽孢中的一種重要的標志物吡啶2，6-二羧酸（DPA）。以聚乙烯吡咯烷酮（PVP）為粘合劑，將60 nm的金粒子組裝到表面打磨光滑的金電極上，制備穩(wěn)定、靈敏的SERS基底。通過不同pH值下吸附在金基底上的DPA的SERS特征，考察DPA分子吸附構型發(fā)生的變化，并分析酸根離子對其吸附的影響。結果表明: 在強酸條件下，DPA在Au NPs/PVP/Au基底上的SERS信號能達到最大增強；當pH值大于DPA二級解離常數(shù)時，DPA的SERS特征逐漸減弱。在DPA中引入不同酸根鹽時，后者會取代納米金表面的檸檬酸根所占的部分位點，改變Au NPs-Au基底的SERS增強性能。3種酸根吸附性能不同，所以獲得的光譜強度存在差異。

關鍵詞 吡啶-2，6-二羧酸；表面增強拉曼散射；金納米顆粒/聚乙烯吡咯烷酮/金基底；吸附構型

2010-10-04收稿；2011-01-06接受

本文系國家自然科學基金（Nos.20605007， 20675005， 20775023）， “973”國家重點基礎研究計劃 （No.2007CB310500）資助

* E-mail: shuangyanhuan@yahoo.com.cn

1 引言

內生芽孢是某些細菌的一種休眠體形式，分布廣泛，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處，具有很強的耐熱、抗輻射、抗干燥、抗化學藥物等能力。在一定條件下，芽孢很容易萌發(fā)為菌體。能形成芽孢的菌種主要是桿菌菌屬。某些芽孢桿菌，如蠟樣芽孢桿菌容易引發(fā)食物中毒；炭疽芽孢桿菌在軍事上一直被列為頭號生物戰(zhàn)劑，吸入致死劑量（LD₅₀）為10⁴個孢子。

光譜法檢測芽孢桿菌通常是通過檢測酸性或鈣螯合的吡啶2，6-二羧酸（DPA）實現(xiàn)的^［1］。DPA約占芽孢桿菌干重的5%～10%，在其它類型的孢子、營養(yǎng)體或菌體中不常見，是芽孢桿菌特有的生物標志物，容易被提取出來，因此通過檢測DPA，可以實現(xiàn)對芽孢桿菌的分析。

關于DPA的研究已多有報道^［2～13］，但多是基于銀納米粒子（Ag NPs）的SERS基底，并且DPA在銀基底表面的吸附構型已經(jīng)基本確定。考慮到Ag NPs容易氧化而存在的不穩(wěn)定性，本研究組曾采用金納米粒子（Au NPs）制得一種靈敏、穩(wěn)定的SERS基底^{［14，15］}。本研究以DPA為自組裝分子，對其在基于Au NPs的SERS基底上的吸附模式進行了研究。由于DPA分子具有兩個羧基，存在兩級解離常數(shù)pK_a1＝2.3和pK_a2＝4.5^［16］。在不同pH值條件下，酸離解H^＋的能力不同，可能導致DPA在SERS基底上的吸附構型的改變。要實現(xiàn)靈敏檢測這樣的生物標志物，就有必要優(yōu)化檢測條件，確定其在何種情況下可獲得最大的表面增強，達到簡便、快捷、靈敏檢測生物標志物的目的。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑UV-2450型紫外分光分度計，JSM-6700F型掃描電鏡（日本JEOL公司）。RamLab-010共焦顯微拉曼儀（法國Jobin Yvon公司）。實驗中，采用工作距離為8 mm的50倍長焦鏡頭，采用氦氖激光器的632.8 nm線激發(fā)，功率為 0.1 mW，曝光時間為10 s，2 次累積。該鏡頭所照射樣品面積為2 SymbolmA@ m×2 SymbolmA@ m。拉曼儀器狹縫寬度為100 SymbolmA@ m，針孔大小為1000 SymbolmA@ m。

吡啶2，6-二羧酸（DPA，純度99.5%，Sigma-Aldrich 公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、HAuCl₄·3H₂O、NH₂OH·HCl、檸檬酸鈉、HCl、HNO₃、H₂SO₄、NaOH（分析純，上海國藥化學試劑有限公司）。實驗用水均為Nanopure Infinity Ultrapure處理系統(tǒng)（美國Barnstead/Thermolyne公司）提供的去離子水（18.32 MΩ cm） 。

2.2 實驗方法

2.2.1 納米金溶膠的合成 根據(jù)文獻［17］所闡述的金種子長大法合成了直徑60 nm的金納米溶膠： 首先將1.7 mL 1% HAuCl₄溶液加入到50 mL水中，加熱至沸，然后迅速加入5 mL 1%檸檬酸鈉溶液，并持續(xù)沸騰15 min，溶液顏色迅速由淺黃色變?yōu)闊o色、黑色，最后得到酒紅色膠體溶液，在室溫下冷卻，于4 ℃保存。溶液用紫外可見光譜表征，在518 nm處有一個吸收峰，對應的金顆粒的粒徑為13 nm。

60 nm Au NPs的制備：將適量的金種子加入到0.5 mL 1% HAuCl₄溶液、2.1 mL 40 mmol/L NH₂OH·HCl溶液及95 mL水的溶液中。反應在室溫下進行。

2.2.2 SERS基底的制備 參考文獻［18］，以PVP為粘合劑，將Au NPs組裝到表面打磨光滑的金電極上。即將表面積為0.126 cm²的金電極用0.05 SymbolmA@ m Al₂O₃拋光后，用去離子水清洗，再將拋光好的金電極置于2% PVP-乙醇溶液中5 h，以便讓PVP組裝到金電極表面上。用去離子水數(shù)次沖洗組裝好PVP的金電極后，將金電極浸入含有所需粒徑的納米金溶膠中12 h，即可將Au NPs固定到金電極（AuNPs/PVP/Au）表面上。使用之前將AuNPs/PVP/Au用去離子水沖洗數(shù)次。

2.2.3 酸堿性被測液的配制 HCl， H₂SO₄， HNO₃及NaOH被用于調節(jié)DPA溶液的pH值，并配制等pH值的空白液。另外，NaCl， MgSO₄及NaNO₃被用于考察酸根離子對吸附在SERS基底上的DPA分子構型的影響。

3 結果與討論

3.1 金納米顆粒/金基底的表征

利用紫外可見（UV-Vis）吸收光譜和掃描電鏡（FE-SEM）對合成的Au NPs的尺寸和形貌進行表征。圖1a為60 nm的Au NPs的紫外可見吸收光譜圖。從圖1可見，合成Au NPs的表面等離子體（SPR）吸收峰位于535 nm，與文獻［19］一致。

圖1b是所制備的60 nm Au NPs組裝在修飾了PVP的玻片上的掃描電鏡（SEM）圖。可以觀察到，經(jīng)過上述3步種子法合成得到的Au NPs大多呈球形，且尺寸分布比較均勻，粒徑分布為（61.8 SymbolqB@ 4.2）nm，與紫外可見吸收光譜圖中觀察到的數(shù)據(jù)一致。

3.2 DPA的SERS特征

3.2.1 SERS強度對pH值的依賴性 文獻［16］報道的DPA的兩級離解平衡常數(shù)分別為pK_a1＝2.3，pK_a2＝4.5。在不同pH值條件下酸離解H^＋的能力不同，可能對其在SERS基底上的吸附構型造成影響。本研究考察了pH值與DPA的SERS信號的相關性。配制的DPA原液經(jīng)pH計測定pH≈3.6。為了得到不同的pH梯度，采用HCl標準液分別調節(jié)DPA，得到3個酸性較強的溶液（pH 1.3， 2.0和2.3）；采用NaOH標準液調節(jié)DPA，獲得1個pH 7.0的中性溶液。

圖2為利用60 nm Au NPs-Au基底檢測不同pH值條件下DPA所獲得的一系列SERS光譜曲線。pH值不同，DPA在1003 cm^－1附近（全對稱環(huán)呼吸振動）和1038 cm^－1處（三角對稱畸變）的兩個特征峰的強度也不同。與DPA原液相比（pH≈3.6，圖2d），隨著酸性的增強（圖2c～2a），峰強度明顯上升。而DPA的中性溶液（pH 7.0，圖2e）的SERS峰強度未達到最強酸度時的1/7，三角對稱畸變峰的特征也基本觀察不到。

分別用H₂SO₄和HNO₃標準溶液將DPA調至pH≈1.3。如圖3A所示，H₂SO₄調節(jié)后的DPA（曲線b）在Au NPs-Au 基底上采集到的SERS強度比利用HCl調節(jié)（曲線a）的弱，而用HNO₃處理DPA（曲線c）的SERS響應更次之。圖3A的插圖是上述3種酸在Au NPs-Au基底上的空白實驗，從中可見3種酸的特征峰。H₂SO₄在982 cm^－1處出現(xiàn)SO^2－₄的特征峰^［20］，HNO₃的特征峰在1047 cm^－1附近^［21］，然而HCl在800～1200 cm^－1區(qū)域沒有出現(xiàn)明顯的SERS信號。

3.2.2 pH值與吸附構型間關系的理論分析 由圖2和圖3可明顯觀察到，經(jīng)過酸調節(jié)后的DPA溶液（即：pH值小于DPA原液酸度值）在檢測中能獲得更強的表面增強拉曼信號；pH＞3.6時，如pH≈7（圖2e），幾乎檢測不到DPA的信號。DPA原液的pH值在DPA的兩級解離常數(shù)^［16］之間。即當被測液的pH值在2.3～4.5范圍時，DPA分子上的兩個羧基（COOH）必然發(fā)生一級解離，即解離出其中的一個H^＋。

本研究組曾討論過DPA（pH≈3.6）在銀和金表面上的吸附方式不同^{［14，15］}。DPA的研究工作多以銀為基底^{［6，11，13］}，并且普遍認為DPA是通過羧基與銀粒子表面相互作用的，故主要分析與 （COOH）有關的特征峰。DPA在AuNPs/Au上的具體吸附模式尚未有定論。但在金表面未觀察到明顯的840和1380 cm^－1COOH^{［22，23］}與Au的特征峰。DPA不可能通過1個或2個羧基綁定的吸附模式^{［14，15］}。本實驗中，隨著pH值的降低，1003 cm^－1峰顯著增強，該峰屬于吡啶環(huán)的呼吸振動，其它振動模式對應的峰增強均不明顯。根據(jù)SERS的表面選律，與法線平行的振動才容易被增強，推測大多數(shù)DPA分子是以直立的形式平行排列的，環(huán)平面處于與法線平行的狀態(tài)。當酸度增強時，吡啶環(huán)上N原子會被質子化，與荷負電的基底表面靜電作用力加強。這與文獻［24，25］在研究pH值對吡啶甲酸在Ag粒子表面的SERS特征影響時，發(fā)現(xiàn)強酸條件下吡啶環(huán)上N原子會發(fā)生質子化得到增強結果類似。另一方面，pH值降低的同時也觀察到1120 cm^－1區(qū)間的共振峰得到了增強。該峰的增強說明吡啶環(huán)與Au基底之間π電子共軛作用加強。由此推測，還有少數(shù)分子仍然是以平躺或斜躺的形式吸附在基底表面，如圖4A所示。

基于以上理論分析，結合圖2和圖3中觀察到的SERS特征，可以認為：當pH＜2.3時，DPA是以質子化分子或分子的形式存在，多數(shù)分子垂直排列，少數(shù)分子平躺或斜躺；質子化的分子主要通過靜電引力與基底作用，平躺的分子通過π電子作用與基底表面結合。此時DPA分子與納米金的距離最小，所以SERS信號得到了極大增強。被測液的pH值在2.3～4.5范圍時，由于部分DPA一級解離的羧基負離子的存在，對吡啶環(huán)和金表面間的有效相互作用構成了障礙，DPA分子與納米金之間的距離增大，SERS峰強度減弱。pH＞4.5時，溶液中的DPA足以發(fā)生二次解離，產(chǎn)生2個COOH，給吡啶環(huán)與金表面間的相互作用帶來更明顯的阻礙效應，此時DPA分子與納米金之間的距離進一步增大，SERS信號增強明顯減弱。詳細圖解見圖4B。

如圖5所示，加入NaCl， MgSO₄及NaNO₃后，DPA的SERS信號均受到影響，其中NaCl （圖5a）的最明顯。有關引入鹽后的DPA在基于銀的SERS基底上信號發(fā)生變化已有報道^{［11，13］}。Bell等^［13］在DPA中加入鹵化鹽，導致其在銀溶膠中的SERS信號消失；加入Na₂SO₄卻能使DPA的信號得到顯著的提升。研究者給出的解釋是SO^2－₄與容易氧化的Ag粒子形成的Ag₂SO₄在水溶液中的溶度積K_sp（K_sp＝ 1.20 × 10^－5 mol³/dm⁹）比其它常用于團聚的鹽大得多（如AgCl，K_sp＝1.77×10^－10 mol²/dm⁶），所以即使Ag團聚，也因為其表面再無強吸附力的陰離子而使得帶有羧根負電荷的DPA輕易地接近Ag粒子的表面。然后SERS信號極大提升也僅發(fā)生在SO^2－₄濃度相對較高的范圍（如0.1 mol/dm³）。本研究使用的是基于Au NPs的基底，在本研究組曾選用Au制備基底^{［14，15］}，也正是考慮到Ag溶膠的一些局限性，尤其是在生物體系中直接用作SERS基底時Ag表面易氧化的趨勢、對某些細菌有表面活性以及組裝生物活性種類的限制。而相比之下Au粒子具有更廣的生物兼容性、抵制表面氧化的穩(wěn)定性和在表面組裝生物分子的多樣性。基于Au粒子的SERS檢測中加入的Cl^－、SO^2－₄及NO^－₃等酸根離子無法與Au形成具有一定溶解度的產(chǎn)物，但會取代納米金表面的檸檬酸根的部分位點，改變Au NPs-Au基底的SERS增強性能，3種酸根吸附性能不同，光譜強度存在一定差異（圖5）。但3種鹽加入后得到的光譜強度均低于DPA原液和強酸性條件的SERS強度，因為加入鹽溶液，DPA分子不能被質子化，而且DPA是一種弱酸，在溶液中部分DPA分子會解離出H^＋，所以部分DPA分子以陰離子形式存在。加入Cl^－后，Cl^－與DPA分子存在競爭吸附，由于Cl^－體積小，與金基底表面結合能力比較強，因此能夠取代更多的檸檬酸根，占了更多的表面位點，所以不利于DPA分子吸附在基底上，從而DPA分子的SERS信號降低。這表明強酸會導致吡啶環(huán)的N原子質子化，H^＋可以作為DPA與酸根吸附的基底之間的橋梁，如圖4A所示，但是金屬正離子卻不具備這樣的能力，無法充當橋梁的作用，SERS信號不能得到增強。

由此推測，圖3A中利用3種酸調節(jié)等pH值的DPA在SERS檢測中強度上的差別可能是酸根性質的差異引起的；等pH值條件下，DPA上N的質子化程度相當，而Cl^－相對于SO^2－₄和NO^－₃， 與質子化的N的結合力強得多，并且Cl^－的體積小得多；Cl^－更容易取代檸檬酸根。質子化的DPA分子與基底之間的有效距離比SO^2－₄和NO^－₃小得多，這樣得到的增強效果更顯著。多次平行實驗結果均表明，采用HCl調節(jié)得到的SERS強度均比H₂SO₄和HNO₃強很多。

4 結論

利用AuNPs/PVP/Au復合型SERS基底來檢測DPA這種細菌芽孢中的重要的標志物。為了優(yōu)化實驗參數(shù)而改變被測液的pH值。結果發(fā)現(xiàn)，吸附在金基底上的DPA的SERS特征發(fā)生了變化，理論分析了DPA分子吸附構型的轉變，并考察了鹽對DPA分子吸附的消極影響。實驗表明，強酸條件有利于DPA在AuNPs/PVP/Au基底上的吸附，而大于DPA二級解離常數(shù)的pH值范圍里由于存在的位阻效應以及橋梁作用的消失，使得DPA在金粒子表面的SERS信號逐漸減弱。另外，鹽的引入會發(fā)生酸根負離子替換檸檬酸根在Au NPs表面的部分吸附位點，從而改變了Au NPs-Au基底的SERS增強性能。 還需要更深入地研究和優(yōu)化此類生物標志物的SERS檢測條件，以便擴展這類基底在生物的靈敏檢測方面的應用。

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Influence of pH Value and Anion on Surface Enhanced Raman Scatteringof 2，6-Pyridinedicarboxylic Acid on Gold Nanoparticle Suface

LUO Wei-Qi， CHENG Han-Wen， HUAN Shuang-Yan^*， WEN Guo-Li，CHEN Yuan-Yuan， SHEN Guo-Li， YU Ru-Qin

（State Key Laboratory for Chemo/Biosensing and Chemometrics，College of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan University， Changsha 410082）

Abstract Surface enhanced Raman scattering （SERS） was used for the detection of 2，6-pyridinedicarboxylic acid （DPA）， a biomarker for bacterial spores. The gold nanoparticles of 60 nm diameters were immobilized on a polished Au electrode using PVP as an adhesive layer. We demonstrated that the fabricated SERS substrates were steady and highly sensitive. The influence of pH and anions about the adsorption mechanism of DPA on colloidal gold nanoparticles has been examined by SERS. The results showed that using a gold nanoparticle/polyvinylpyrrolidone/gold substrate （AuNPs/PVP/Au） for detection of DPA exhibited a maximum enhancement of SERS signal at low pH， however the SERS features and intensity of DPA were found to weaken when pH was greater than pK_a2. The effect of different anions on the adsorption mechanism of this molecule was also investigated， the SERS effect on Au NPs-Au substrate had changed， since the anions may replace the partial sites of the citrate on the gold surface. Owing to the different adsorption mechanism of the three anions， the difference of SERS intensity was observed on the addition of different anions.

Keywords 2，6-Pyridinedicarboxylic acid；Surface enhanced Raman scattering；Gold nanoparticle/polyvinylpyrrolidone/gold substrate；Adsorption mechanism

（Received 4 October 2010accepted 6 January 2011）