胡柚上柑橘衰退病毒的分子檢測

武曉云，劉 琦，郭玉雙，武小霞

（1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2.黑龍江省農業科學院園藝分院，哈爾濱 150086；3.貴州省煙草科學研究所，貴陽 550081；4.東北農業大學農學院，大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

胡柚（Citrus changshanensis）原產于浙江省常山縣，是一種重要的地方特色柑橘良種[1]。胡柚果實色澤艷麗、果型美觀、耐儲藏，并且富含多種維生素和人體必需氨基酸和豐富的柑橘類黃酮物質，如柚皮苷（Naringenin）和新桔皮苷（Neohesperidin）等，因此是一種非常值得推廣和扶持的柑橘品種[2]。目前，胡柚已成為我國主要栽培柑橘品種之一：全國的種植面積多達一百多萬畝，栽培種植的省份包括浙江省、江西省、福建省和湖南省、年均產量100多萬t，年產值近20億元。

胡柚黃斑病是胡柚常見病害之一，染病植株葉片較正常植株明顯減少，并且葉片出現黃化癥狀，植株不能結果或減少，并且果實出現變小、酸味增加。該病害最早報道于上世紀90年代，由于當時條件所限該病害被認為由真菌或細菌引起[3-4]。近年來，該病害的發生范圍不斷擴大，有暴發流行之趨勢，該病害已嚴重影響胡柚的產量和品質，可能對胡柚整個產業的進一步發展造成嚴重影響。但是，該病害的病原至今未能得到系統的鑒定，因此嚴重影響相應防治措施的制定。本文通過血清學和分子生物學檢測，從癥狀表現葉片黃化的胡柚植株中檢出柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV），并對胡柚上克隆CTV病毒外殼蛋白（CP）基因的序列與GenBank中登陸的相應序列進行了分析，結果表明胡柚黃斑病可能由CTV一個新的分離物引起。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

胡柚葉片采集自浙江省常山縣，癥狀表現為葉片黃化，具體采集信息見表1。

表1 胡柚樣品采集地點、采集時間及癥狀Table 1 List of sampling locations and time,and symptoms of Huyou

1.2 血清學檢測

采用Agdia公司的CTV ELISA Reagent Set試劑盒進行DAS-ELISA檢測，并參照Agdia公司提供的試劑盒說明書進行。DAS-ELISA的陽性對照購自Agdia公司，陰性對照采用健康胡柚葉片（由常山縣農業局植保植檢站提供）。

1.3RT-PCR擴增和克隆

用TRIzol Reagent（Invitrogen公司）提取胡柚葉片的總RNA。根據文獻[5]報道，設計CTV外殼蛋白（CP）基因的通用引物 CP1（5′ATGGACGACGAAA CAAAGA 3′）和 CP3（5′TCAACGTGTGTTGAATTTCC 3′）。用M-MLV試劑盒（Promega公司）根據試劑盒提供的試驗步驟配制反轉錄反應混合液，以CP3為引物合成cDNA第一鏈。以CP1和CP3為引物進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖進行電泳檢測。擴增片段用DNA膠回收試劑盒（Axygen公司）進行回收后，連接至pGEM-T載體（Promega公司）中，并進行測序測定。

1.4 序列分析

序列拼接和同源性分析采用DNAman 6.02（Lynnon Biosoft）程序進行；應用Clustal X 1.83程序進行多序列比對[6]，用MEGA4.0程序中的最大簡約法（Maximum parsimony，MP）構建系統進化樹，進化樹的可信度用bootstrap進行檢測（1 000次重復）[7]。系統進化樹中其他CTV分離物及GenBank登錄號如下：B165（Accession EU076703）、Mexico（DQ272579）、NUagA（AB046398）、NZ-B18（FJ525436）、NZRB-G90（FJ525432）、NZRB-M12（FJ525431）、NZRB-M17（FJ525435）、NZRB-TH28（FJ525433）、NZRB-TH30（FJ525434）、Qaha（AY340974）、SY568（AF001623）、T30（AF260651）、T36（U16304）、T318A（DQ151548）、T385（Y18420）、HA16-5（GQ454870）、P09.18（GQ424346）和 VT（U56902）。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀觀察

對浙江省主要胡柚種植區衢州市和常山縣5處胡柚種植株園的胡柚的田間調查表明，胡柚黃化病的發病率在2.3%左右。癥狀主要包括植株葉片減少、脈間黃化（見圖1），結果數量及質量降低，大部分發病植株的莖部不出現莖點的癥狀，少數植株具輕微的莖點癥狀。由于發病植株分布具有分散性和不連續性，且路邊植株的發病率較中間高，具有病毒病害的特征。

圖1 胡柚黃化癥狀Fig.1 Yelllowing symptoms of Huyou

2.2DAS-ELISA檢測

用DAS-ELISA對采集的18個植株表現黃化癥狀的胡柚進行了檢測，結果表明除CS-3、CS-6和QZ-7外，其余15個樣品與CTV抗血清均有反應。其中，CS-7與CTV抗體的反應最強（OD值為3.783），約為陽性對照的3倍，其余樣品與CTV抗體的反應較弱（見表2）。表明，胡柚黃化病可能與CTV病毒有關。為進一步明確感染胡柚的CTV株系，我們對CS-7樣品進行了進一步的分析。

2.3RT-PCR擴增

用CP3進行反轉錄后，用CP1和CP3進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增的目的條帶約700 bp，與預期條帶大小一致（見圖2）。PCR產物經純化、克隆、測序分析發現，擴增至目的片段長672 bp（GenBank登陸號：HQ634290）。Blastn同源性搜索結果表明該片段與CTV P09.18分離物（GQ424346）的CP基因具最高相似性，為97.17%[8]。

表2 胡柚樣品的DAS-ELISA檢測Table 2 DAS-ELISA detection results of different Huyou samples

圖2 CS-7樣品的RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR detection of CS-7

2.4 同源性分析

將克隆的CS-7 CP基因與CTV GenBank中的其他CTV分離物的相應序列用Clustal X 1.83程序進行多序列比對后進行同源性分析。結果表明，在核苷酸水平上，CS-7與P09.18相似性最高（97.0%），其次分別是 NZRB-TH30（96.8%）、NZRB-M17（96.6%）、NZRB-M12（96.5%）、NZRBTH28（96.5%）；在氨基酸水平上，CS-7與P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH28的相似性都為96.6%（見表3）。表明CS-7與P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH28具有較近的遺傳關系。

表3 CS-7 major CP的核苷酸及氨基酸序列與CTV不同分離物之間相似性比較Table 3 Similarity between nucleotide and amino acid sequences of major CP of CS-7 and other CTV isolates

2.5 系統進化分析

將克隆的CTV CS-7分離物的CP基因與GenBank中的其他CTV分離物的相應序列用MEGA 4.0程序構建系統進化樹（見圖3）。在系統進化樹中，CS-7與P09.18聚于一小分支后再與NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH30 4個分離物形成一個單獨的分支，進一步表明 CS-7 與 P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28具有較近的進化關系。

圖3 CS-7與其他CTV分離物構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CS-7 and other CTV isolates

3 討論

CTV屬于長線型病毒科（Closteroviridae）長線型病毒屬（Closterovirus），是世界范圍內危害最強、經濟意義最為重要的柑橘病害之一[9]。該病毒在我國也普遍發生，全國幾乎所有的柑橘種植區都有該病毒發生與為害的報道[10-14]。CTV的寄主范圍僅限于蕓香科植物，研究表明CTV可侵染絕大多數栽培的柑橘品種。但是，胡柚上至今還未見有CTV分布與為害的報道。本研究首次從血清學和分子水平證實了CTV病毒在胡柚上的存在，表明胡柚也是CTV的寄主之一。

根據對寄主植物造成的癥狀，CTV可粗分為4個株系：莖陷點株系（Stem-pitting，SP）、衰退株系（Decline inducing，DI）、苗黃化株系（Seedling yellows，SY）和弱癥狀株系[9，15]。其中 SP 株系以分離物VT為代表，DI株系以T30為代表，SY株系以T36為代表。王洪祥等對浙江省黃巖的“本地早”（Citrus succosa）密柑上的CTV進行了研究[16]，結果表明CTV在“本地早”發生相當普遍，株莖陷點株系、衰退株系和苗黃化株系都有存在，并且發現苗黃株系或強莖陷點株系和碎葉病毒存在復合感染，這是造成黃巖本地早和新本1號產量低下的一個重要原因。在系統進化樹中本文分離的CTV株系（CS-7）與上述株系都有較遠的遺傳距離，而與P09.18、NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH30聚于一分支，表明CS-7可能是CTV一個新的可誘導胡柚植株黃化癥狀的株系。CTV P09.18分離自美國的California，而NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28來自于新西蘭。由于柑橘起源于我國及東南亞等地區，因此P09.18和NZRB-TH30等美國和新西蘭的CTV可能通過柑橘及其種苗等的貿易被傳入。

在血清學檢測中，不同的分離物與抗血清有著不同的反應，表明侵染胡柚的CTV可能也由不同的株系存在，并且可能存在復合侵染現象。因此，有必要擴大樣品采集范圍，對胡柚上CTV的株系組成以及為害進行更系統的研究，為胡柚黃斑病的防治提供理論基礎。雖然，我們從植株表現黃化的胡柚中檢測到了CTV病毒，但是胡柚植株黃化癥狀是否由CTV引起，還有待將該分離物接種至健康胡柚幼苗并完成柯赫氏法則鑒定，但是這最少需要1～2年的時間才可能有結果。

*武小霞為本文的同等貢獻者。

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