同型半胱氨酸對人臍靜脈內皮細胞IκB和NF-κB表達的影響*

徐 倩 周曉慧 曹 凱 牛成偉 張金環 胡欣欣

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是非蛋白構成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中的一個重要中間產物。研究表明Hcy可以促進動脈粥樣硬化及血栓的形成[1]。本研究通過觀察在Hcy刺激下人臍靜脈內皮細胞（human umbilical veins en?dothelial cells，HUVECs）的核因子（NF）-κB、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）的表達情況，探討Hcy致動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的機制，為臨床預防治療AS提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Hcy、四甲基噻唑氮藍（MTT）均購自Sigma公司，DMEM培養基購自Gibco公司，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自pepro Tech公司。Trizol購自invitrogen公司。鼠抗人NF-κB p65抗體、β-actin抗體購自Santa Cruz公司。兔抗人IκB-α一抗，二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶標記）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購自寶生物工程（大連）有限公司。 HERAcell 150型CO2孵育箱（Heraeus公司）、LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡（Wetzlar GmbH公司）、凈化工作臺（上海新苗醫療器械制造有限公司）、Multiskan Mk3酶聯儀（芬蘭）、DYY-7型轉移電泳儀（北京市六一儀器廠）、PTC-100（MJ RESEARCH, INC）、紫外可見分光光度計（DU800）購自BECKMAN COUL?TER公司。

1.2 HUVECs培養及分組 取健康剖宮產新生胎兒臍帶，PBS液沖洗干凈，用1∶1的0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%的胰酶-0.02% EDTA（V∶V=1∶1）消化13 min，收集消化液，1 000 r/min離心10 min后，棄上清，用含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培養基重懸，接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后換液，待細胞達到80%融合時，用0.125%胰酶-0.01%EDTA（V∶V=1∶1）傳代培養，實驗用第2、3代細胞，分組如下：正常對照組細胞加含20%胎牛血清和10 μg/L bFGF的DMEM培養基；Hcy劑量組細胞在加入上述培養基基礎上再分為4組，分別加入2.5 mmol/L Hcy（H1）、5 mmol/L Hcy（H2）、10 mmol/L Hcy（H3）及15 mmol/L Hcy（H4）。

1.3 MTT法檢測細胞活性 將第2代HUVECs細胞以1.0× 108/L密度種于96孔板中，在37℃，5%CO2培養箱內培養至細胞達到80%融合時，按上述實驗分組處理，培養24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL繼續培養4 h，吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL。振蕩溶解后，用酶標儀測定在波長490 nm處各孔的光密度（OD）值。

1.4 RT-PCR檢測不同濃度Hcy對HUVECs中NF-κB p65 mRNA表達的影響 將第2代HUVECs細胞接種于24孔培養板中，每孔加入Trizol 300 μL，提取各組細胞總RNA。按Ta?KaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0試劑盒說明進行逆轉錄反應。NF-κB p65引物上游為5-GCACTTACGGATTCTGGT GG-3，下游為5-CTCAAACGCTGGTGTTAGGC-3；擴增片段426 bp。β-actin引物上游5-AGCGGGAAATCGTGCGT GAC-3，下游為5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，擴增片段為453 bp。PCR反應體系為20 μL。NF-κB p65 PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環。最后10℃延伸10 min。β-actin的退火溫度為58℃。取5 μL PCR產物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察并攝取圖象。NF-κB p65 mRNA相對表達強度=NF-κB p65 mRNA掃描值/β-actin掃描值。

1.5 Western blot檢測不同濃度Hcy對HUVECs中IκB-α蛋白表達的影響 將第2代HUVECs細胞接種于25 cm2培養瓶中，提取細胞總蛋白，用二喹林甲酸（BCA）法測定總蛋白濃度。取30 μL蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，電轉移2 h至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后與1∶200稀釋的兔抗人IκB-α一抗4℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，再與化學發光試劑（ECL）室溫作用3 min，后曝光、顯影和定影。膠片掃描后，采用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，計算IκB-α條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為IκB-α蛋白的相對表達水平。

1.6 免疫組化檢測各組HUVECs中NF-κB p65核轉移的變化 第3代細胞接種于有蓋玻片的小培養皿中。方法:（1）丙酮固定10 min。（2）3%H2O2封閉10 min。（3）滴加A液，37℃孵育30 min。（4）加鼠抗人NF-κB p65一抗（1∶50）于4℃過夜。（5）滴加B液，37℃孵育30 min。（6）滴加C液，37℃孵育30 min。（7）顯色，復染。以上每步之間用PBS洗3次，每次5 min。（8）脫水，封片。（9）在Mivnt顯微圖像分析系統下進行半定量分析。顯棕黃色顆粒為陽性。對采集的圖片中棕黃色陽性顆粒進行密度掃描，測平均灰度值，觀察NF-κB p65核轉移變化.

1.7 統計學處理 運用SPSS 11.5進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞生長及NF-κB p65 mRNA表達的影響 H1組較對照組對正常細胞生長的抑制作用不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），其他各組與對照組間OD值差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；Hcy抑制HUVECs的生長隨著濃度的升高有增強趨勢。H1、H2、H3及H4組較對照組NF-κB p65 mRNA的表達均明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著濃度升高，Hcy對HUVECs細胞NF-κB p65 mRNA表達的影響呈遞增的劑量依賴趨勢，見圖1、表1。

表1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞活力及NF-kBP65 mRNA表達的的影響 （±s）

表1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞活力及NF-kBP65 mRNA表達的的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n OD值 統計學處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.546 7±0.049 3 0.525 0±0.032 1 0.498 3±0.033 1 0.373 3±0.045 9 0.295 0±0.032 1 46.015組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）0.348 0.043＜0.001＜0.001組別 n NF-κB p65/β-actin 統計學處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.463 3±0.030 8 0.539 4±0.009 3 0.683 8±0.034 8 0.779 9±0.021 2 0.912 6±0.016 4 165.264＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.013＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001

2.2 Western blot及免疫組化結果 H1、H2、H3及H4組IκB-α蛋白的表達與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著濃度的升高，IκB-α/ β-actin呈遞減趨勢。對照組NF-κB p65在細胞中基本無表達，Hcy各處理組HUVECs細胞中可見NF-κB p65陽性產物棕黃色顆粒，H1、H2組陽性表達顆粒較少，主要分布在細胞質中；H3、H4組陽性表達顆粒明顯增加，胞質及胞核內均有分布，胞核內明顯增加；H4組陽性表達顆粒核內分布尤為明顯，見表2、圖2。

3 討論

高Hcy是導致動脈粥樣硬化的一種獨立危險因素，流行病學的研究報道顯示，大約有40%的冠心病和腦血管動脈粥樣硬化的患者存在高Hcy血癥[2]。目前研究認為內皮損傷是導致AS的始動因素之一[3]，并提出AS是一系列復雜的慢性炎癥反應的過程[4]，在這一過程中NF-κB發揮重要的調控作用。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內的基因多顯性轉錄核因子，控制著細胞因子、黏附因子等基因的表達。NF-κB的2個亞基p50、p65屬于DNA結合蛋白Rel家族[5]。一般情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結合，使NF-κB滯留在胞質中呈非活性狀態[6]。受到刺激后，IκB激酶被激活，使IκB蛋白降解，NF-κB從多聚體上釋放出來，進入細胞核，與DNA結合，調控細胞因子、黏附分子及生長因子的基因表達[7]，因而使這些基因控制的細胞因子、黏附分子等增多。大量的單核細胞趨化蛋白、細胞間黏附分子促進單核細胞與內皮細胞黏附并向內皮下遷移及泡沫化，從而形成脂質條紋、纖維斑塊、粥樣斑塊，進而導致AS的形成[8]。

表2 不同濃度Hcy對HUVECs細胞IκB-α蛋白表達及NF-κB p65核轉移的影響 （±s）

表2 不同濃度Hcy對HUVECs細胞IκB-α蛋白表達及NF-κB p65核轉移的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n IκB-α/β-actin 統計學處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 1.109 5±0.0120 1 1.036 9±0.0298 9 0.918 1±0.0440 1 0.597 1±0.0224 4 0.329 7±0.0243 0 394.652＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.011＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別 n NF-κB p65統計學處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.022 6±0.003 3 0.103 6±0.017 6 0.227 8±0.020 1 0.599 7±0.039 1 0.822 2±0.024 9 1 223.400＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

本實驗結果顯示，隨著Hcy濃度的升高，細胞活力逐漸下降，細胞形態變化越來越差，表明Hcy對內皮細胞有明顯的損傷作用，濃度越高損傷越嚴重；Hcy可使NF-κB p65 mRNA表達顯著增強，表明Hcy可促進NF-κB p65的轉錄；且隨著Hcy濃度的升高，IκB的含量下降，并呈劑量依賴趨勢。隨著Hcy濃度的升高，NF-κB p65激活后進入細胞核，NF-κB p65在細胞核中的含量明顯增多，表明Hcy對NF-κB具有激活作用。

綜上所述，Hcy不僅促進NF-κB轉錄水平的表達，而且可促使IκB的降解，使NF-κB p65被釋放、激活，進而轉移至細胞核內，提示進入細胞核內的NF-κB p65在轉錄水平將可能促進其下游的趨化蛋白因子、細胞間黏附分子等基因表達，使單核細胞與內皮細胞黏附，進一步損傷血管內皮，促進動脈粥樣硬化的形成和發展。由于NF-κB在誘導炎癥反應，促進AS形成的病理過程中起重要作用，因此可以通過抑制過度活化的NF-κB，下調其調控促炎因子的表達，抑制多種黏附分子及細胞因子，從而有效地抑制炎癥反應，延緩和逆轉AS的發生和發展，為其預防和治療提供新的策略。

[1]Zhou J,Austin RC.Contributions of hyperhomocysteinemia to ath?erosclerosis:Causal relationship and potential mechanisms[J].Bio?factors，2009,35(2):120-129.

[2]高娟，郭力.同型半胱氨酸與動脈硬化[R].醫學研究與教育，2010,27(1):82-84.

[3]李薇,杜軍保.動脈粥樣硬化發病機制研究進展[R].實用兒科臨床雜志，2009,24（1）：58-60.

[4] El Khatib N，Génieys S，Kazmierczak B，et al.Mathematical model?ling of atherosclerosis as an inflammatory disease[J].Philos Trans?act A Math Phys Eng Sci,2009,367(1908):4877-4886.

[5]Sandur SK,Ahn KS,Ichikawa H,et al.Zyぼamend,apolyherbal prep?aration,Inhibits invasion,suppresses osteoc lastogenesis,and poten?tiates apoptosis through down-regulation of NF-κB activation and NF-κB-regulated gene products[J].Nutr Cancer,2007,57(1):78-87.

[6] Kaushal V，Schlichter LC.Mechanisms of microglia-mediated neu?rotoxicity in a new model of the stroke penumbra［J］.J Neurosci, 2008，28(9):2221-2230.

[7] Donato AJ,Black AD,Jablonski KL,et al.Aging is associated with greater nuclear NF κB,reduced Iκ Bα,and increased expres?sion of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans[J].Aging Cell,2008,7(6),805-812.

[8] 王新,李文杰.NF-κ B與動脈粥樣硬化的相關性及中藥的干預作用[J].遼寧中醫藥大學學報,2009,11(3):55-56.