擬南芥MYBC1轉錄因子介導A BA調節的種子萌發

柏 錫，翟 紅，朱延明

（1.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國科學院東北地理與生態研究所，哈爾濱 150081）

高鹽、干旱和低溫等逆境嚴重影響作物生長發育，造成糧食減產，影響我國乃至世界的糧食安全。因此，如何提高作物耐逆性成為亟待解決的重大問題。隨著擬南芥測序工作的完成，公共數據庫中積累了大量基因序列信息，但90%基因的功能尚未鑒定，這其中蘊含著許多調控植物耐逆的基因資源。生物信息學方法可以有效的從龐大的數據庫中挖掘功能基因，生物信息學的有效挖掘加上反向遺傳學方法的有力驗證可有效獲得功能基因。

MYBC1基因是本實驗室在前期研究中，通過生物信息學方法發掘得到的滲透脅迫候選基因[1]。MYBC1編碼MYB轉錄因子，植物MYB類轉錄因子以含有MYB結構域為共同特征。根據所含MYB結構域的數目，植物中的MYB類轉錄因子可簡單分成3個亞類:只含一個MYB結構的R3亞類[2]；含有兩個MYB結構域的R2R3亞類，R2R3 MYB蛋白是植物體中最大的家族，據統計僅在擬南芥中就有100多種[3-4]；含有3個MYB結構域R1R2R3亞類，主要參與細胞周期的控制和調節細胞的分化[5-6]。僅含有1個或MYB區域的R3亞類，根據是否具有一種稱為端粒盒（TELOBOX）的結構，可以把這類MYB蛋白分成兩個小類[2]。第一小類成員都含有端粒盒結構，如IBP1、BPF1和PcMYB1蛋白等；第二小類成員不含有端粒盒結構，如StMYB1、CCA1、LHY和CPC1蛋白等，不具備端粒盒結構的R3亞類MYB轉錄因子可能作為轉錄抑制子行使功能[7]。

通過前期研究發現，MYBC1能夠負向調節擬南芥的耐冷性，那么MYBC1與干旱、鹽及ABA的關系又是什么樣的呢？MYBC1編碼R3類轉錄MYB轉錄因子，至今還未有報道這類轉錄因子參與了干旱、鹽脅迫反應或ABA信號轉導途徑，因此對這一基因的深入研究十分必要。在我們的前期研究中，分析了MYBC1在擬南芥的葉中的表達模式，在本研究中我們采用Real-time PCR技術，進一步分析了該基因在擬南芥根部，在高鹽、干旱、低溫及ABA處理時的表達模式，并以該基因擬南芥缺失突變體為試材，分析MYBC1基因與干旱、高鹽及ABA的關系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

哥倫比亞野生型擬南芥植株（Wild-type Col-0，WT），由本研究室保存。突變體Salk_072083購自擬南芥突變體庫NASC（The European Arabidopsis Stock Centre）。登錄網站 http://www.arabidopsis.info/，在seach catalogue搜索基因MYBC1（At2g40970）的突變體，選擇T-DNA插入到外顯子，且X值較高的突變體。

1.2 幼苗培養

擬南芥無菌培養采用表面滅菌，70%酒精表面殺菌3～5 min后，用15%Belach浸泡滅菌10～15 min，無菌水洗4～5次。置于4℃處理4 d以促進發芽，然后采用濾紙床液體培養法進行無菌培養，培養裝置如圖1所示。

培養基為1/2 MS液體培養基，16 h光照/8 h黑暗的晝夜節律，光照強度為5000～8000 lx。

圖1 濾紙床液體培養法培養的擬南芥Fig.1 Liquid culture of Arabidopsis thaliana on filterpapers-bed

1.3 脅迫處理

哥倫比亞野生型擬南芥采用濾紙橋液體無菌培養14 d，選取長勢一致的擬南芥幼苗進行脅迫處理。

1.3.1 鹽處理

將原有的1/2MS替換成新鮮的含有300 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養基，置于原生長環境中。在0.5、3、6 h，分別提取擬南芥的地下部分和地上部分的總RNA。

1.3.2 模擬干旱處理

將擬南芥幼苗取出，濾紙輕輕吸干根部水，稱重，置于超凈臺吹干，待失水達50%，將擬南芥幼苗放回原生長環境中復水，并在復水0.5、3、6 h后，分別提取擬南芥的地下部分和地上部分的總RNA。

1.3.3 4℃冷處理

將三角瓶中的液體培養基用事先4℃預冷的培養基替換，然后將整個裝置置于4℃環境中，在0.5、3、6 h，分別提取擬南芥的地下部分和地上部分的總RNA。

1.4 脅迫處理下MYBC1 Real-time RT-PCR表達特性分析

Real-time RT-PCR采用比較CT法（ΔΔCT），以Actin2（At3g18780）為內參基因，以未經處理的樣品作為參照因子。經Actin2基因均一化處理后，通過2-ΔΔCT方法計算目標基因表達量變化差異，以經過處理的樣本相對于未經處理的樣本的倍數來表示。每個樣品做3次技術重復，數據取3次重復的平均值，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。并進行3次獨立的生物學重復，相對表達量為3次生物學重復的平均值。所用引物序列如下:MYBC1-F 5′AAGGCGGGAACGGTAAC 3′與R 5′CTCTAATGGCGGCATCAAG 3′；Actin2-F 5′TTACCCGATGGGCAAGTC 3′與 R 5′GCTCATACGGTCAGCGATAC 3′。

1.5 MYBC1 T-DNA插入突變體的PCR鑒定

采用CTAB法提取突變體的成熟葉片DNA。采用PCR雙引物法對變體進行分型，確定T-DNA雙插入的純合體。兩對引物序列如下:H primer（由位于插入位點兩側的基因特異性引物組成）F:5′TCACTATCACCGCAGCTAGAAT 3′與 R:5′TTTC ATTAATTTCCGGCAGG 3′；T primer（由位于基因內部的特異引物和位于T-DNA左臂引物組成）F:5′TACCAAAAGATCCACCTCG 3′與 R: 5′TGTTAT TAAGTTGTCTAAGCGTC 3′。

H primer PCR擴增條件如下:

1.6 MYBC1 T-DNA插入突變體的RT-PCR鑒定

采用Tiangen的RNA提取試劑盒RNAprep Plant Kit提取野生型擬南芥（Col-0）與T-DNA插入缺失突變體總RNA，并用DNaseⅠ(TaKaRa)消化去除基因組DNA污染。采用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase kit（Invitrogen）反轉錄成 cDNA。以內參基因Actin2為參照，進行半定量RT-PCR分析。引物序列同1.4，擴增條件如下:

MYBC1 PCR擴增條件均為:

Actin2 PCR擴增條件如下:

1.7 擬南芥種子萌發對ABA、鹽及甘露醇敏感性試驗

擬南芥種子經表面消毒后，于4℃春化2～5 d，在無菌條件下點播到3%蔗糖，pH 5.8，1.2 g·L-1MES，添加 0.6μmol·L-1ABA 或 100 mmol·L-1NaCl或150 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培養基上。培養條件為22～23℃，16 h光照/8 h黑暗的晝夜節律，光照強度為5000～8000 lx，培養14 d，觀察擬南芥的生長情況，在播種4 d時統計綠色子葉百分率，生長14 d時拍照并統計根長。

2 結果與分析

2.1 MYBC1的表達特性分析

在前期研究中，分析了MYBC1在擬南芥的葉中經冷、干旱、鹽及ABA處理時的表達量變化[9]。發現在擬南芥的葉中MYBC1在冷處理時下調表達；在干旱、鹽及ABA處理時下調表達（見圖2），那么MYBC1在擬南芥的根中的表達特性是怎樣的呢？我們搜索公共數據庫的芯片結果，發現MYBC1在冷處理時在根與葉中的表達模式不同:在葉中下調表達，但在根中上調表達[8]，MYBC1在根與葉中的表達模式不同，說明它在根與葉中發揮的作用可能也不同。為了更加全面了解MYBC1的表達特性，我們采用Real-time RT-PCR的方法分析了擬南芥根中MYBC1在各種脅迫處理下的表達量變化情況。結果如圖2所示，MYBC1在冷處理時上調表達，但在干旱及鹽處理時表達量不發生變化，在ABA處理時上調表達。

2.2 MYBC1基因缺失純合突變體的獲得

采用“PCR雙引物法”確定T-DNA插入是否純合，進一步采用RT-PCR分析MYBC1基因在TDNA插入突變體植株中是否被沉默。從NASC購買T-DNA插入的突變體Salk_072083。NASC上提供的GSS序列第一個堿基一般被認為是T-DNA插入的位點，實際插入位點可能在0～300bp的范圍內。通過GSS序列與MYBC1基因組序列比對，可知TDNA插入的位點在基因MYBC1內部距離起始密碼子747bp處（見圖3）。

PCR分型結果如圖4、5所示，以基因組DNA為模板用引物T進行PCR擴增時，3、4、6、7、8、14、15、16、18、20、24、25、26 號共 13 株在約750bp的位置出現擴增，表明這13株有TDNA的插入。同時用引物H進行PCR擴增，這13株在673bp位置未出現擴增，說明這13株突變體為T-DNA插入的純合體，如圖5所示。

選取14號進行基因轉錄水平的鑒定，以野生型擬南芥為陽性對照，以內參基因Actin2為參照因子，進行RT-PCR鑒定。由圖6可以看出，基因MYBC1在突變體中沒有被轉錄，說明T-DNA插入到MYBC1后徹底阻斷了基因的轉錄翻譯，14號T-DNA插入純合突變體命名為mybc1，突變體mybc1的種子，用于下一步的表型分析。

圖2 低溫(4℃)、干旱、鹽及ABA處理時基因MYBC1的Real-time RT-PCR轉錄水平定量分析Fig.2 Evaluation of MYBC1 transcript levels by Real-time RT-PCR analysis under stress conditions of cold,dehydration,salt and ABA in 2-week-old wild-type Col-0 plants

圖3 突變體mybc1的T-DNA插入圖譜Fig.3 T-DNA insertion in mybc1

圖4 突變體分型T引物PCR擴增結果Fig.4 Genotyping analysis with primer T by PCR

圖5 突變體分型H引物PCR擴增結果Fig.5 Genotyping analysis with primer H by PCR

圖6 半定量RT-PCR分析MYBC1在純合突變體中的表達Fig.6 Semi RT-PCR analysis of MYBC1 transcription level in mybc1 mutant

2.3 mybc1突變體在種子萌發期表現出對ABA超敏感

為了研究基因MYBC1與ABA之間的關系，我們做了種子萌發對ABA的敏感性試驗。由圖7可以看出，在不含ABA的1/2MS培養基中突變體與野生型都能正常萌發，且萌發率沒有區別。當將突變體與野生型擬南芥的種子播種到含0.6μmol·L-1ABA的1/2MS培養基，mybc1突變體與野生型擬南芥相比，表現出明顯的區別。在播種后4 d時，85.5%的野生型擬南芥能夠展開葉片，但只有10.9%的突變體能夠展開葉片（如圖8所示），且野生型的根長要顯著長于mybc1突變體（P＜0.001）（如圖9所示）。在種子萌發期，mybc1突變體變現出對ABA的更加敏感。但是mybc1突變體與野生型擬南芥的種子在含有100 mmol·L-1NaCl及150 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培養基中萌發率及生長狀況均未發生顯著變化。

圖7 ABA處理下野生型與mybc1突變體種子萌發情況Fig.7 Comparison of germination for wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA

圖8 ABA處理下野生型與mybc1突變體種子萌發后綠色子葉百分率Fig.8 Green cotyledon rates of wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA at 4 d

圖9 ABA處理下野生型與mybc1突變體種子萌發后根長統計Fig.9 Root lengths of wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA at 15 d

3 討論

脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，參與植物的很多生理過程，如種子成熟和萌發、根和莖的生長、氣孔的運動等。ABA還可以作為信號分子誘導脅迫響應基因的表達從而幫助植物去抵御逆境脅迫[10-11]。在ABA信號轉導通路中的基因往往參與了不止一個生物學過程，如ABA信號通路中的核心因子ABI1、ABI2與AtPP2CA等不僅控制了種子的萌發、根的伸長，還控制氣孔的運動[12-14]，這說明ABA控制的生理學過程相互交叉。但是ABA控制的生理學過程又是相對獨立的，如ABA受體FCA不是種子萌發和氣孔關閉所必須的，但在ABA抑制側根形成中起作用[15]；有些基因超量表達后能使植物種子萌發對ABA更為敏感、使植物抗旱能力有所提高，如 AtMYB44、AHK1、SNAC1[16-18]，但也有一些基因同樣使植物種子萌發對ABA更為敏感，但卻使植物抗旱能力下降，如ABI1、ABI2、ABO3[19-21]。在前期研究中發現，MYBC1以不依賴于ABA的途徑調控了擬南芥的耐冷性[9]，在本研究中發現，MYBC1不參與擬南芥抗鹽及抗旱能力的調節，但參與了ABA控制的種子萌發，通過本研究同樣證實了ABA控制的生理學過程是相對獨立的。

MYBC1編碼不具端粒盒結構的R3類MYB蛋白，R3類MYB蛋白是調節植物表皮發育的重要因子，例如CPC與TRY作為負向調節因子參與了表皮細胞的發育[22]。R3類MYB蛋白還被發現參與調節了類黃酮的合成、控制了植物的生物鐘及光敏色素[23-24]。但還尚未見報道R3類MYB蛋白參與了ABA信號轉導通路。本研究證明了MYBC1基因參與ABA信號傳導通路，MYBC1基因特異性調節ABA控制的種子萌發。本研究首次發現了R3類MYB轉錄因子在ABA信號轉導通路起到重要的作用，因此通過本研究拓展了對R3類MYB轉錄因子的認識。

4 結論

本研究采用反向遺傳學的方法研究了MYBC1與干旱、鹽及ABA的關系。采用Real-time RT-PCR的方法研究了MYBC1在擬南芥根部的表達特性，發現MYBC1不能被干旱及鹽誘導表達，但能被冷及外源ABA誘導表達，這說明MYBC1與冷、ABA的關系最為密切。通過PCR和RT-PCR分析鑒定了MYBC1 T-DNA插入的突變體擬南芥mybc1(SALK_072083)。MYBC1的缺失導致擬南芥的種子萌發對ABA更加敏感，但MYBC1并不參與鹽及干旱脅迫反應。本研究首次發現了R3類MYB轉錄因子在ABA信號轉導通路起到重要的作用。

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