不同基因型大豆GS1基因的克隆與分析

陳麗華，劉麗君，劉頁麗，裴宇峰，祖 偉*

（1.國家農業標準化監測與研究中心，哈爾濱 150036；2.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030；3.黑龍江農墾科研育種中心，哈爾濱 150090）

就植物的生長和發育而言，氮素的同化是個十分重要的生理過程。其中，無機氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機氮才能被植物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)是高等植物氮代謝中十分重要的酶，它和谷氨酸合成酶聯合作用，催化氨的同化，使其轉變成Gln和Glu，在高等植物體內含氮有機物的生物合成中作為氮的供體[1]。高等植物的種子、葉、根、根瘤和果實等器官中分布著多種GS的同工酶。在植物葉片中存在兩種GS同工酶：一種定位于細胞質部分，稱為胞液（胞質）型GS-GS1；另一種定位于葉綠體部分，稱為葉綠體型GS-GS2［2］。在此前氮代謝規律的研究中大多將GS酶活性作為主要的測定指標[3-4]，而缺乏不同基因型大豆在GS基因結構和轉錄水平的研究。本試驗通過對不同基因型大豆GS1基因的克隆和分析，為不同基因型大豆GS1基因的功能分析和轉錄水平的定量分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 不同基因型大豆

高油大豆品種：墾豐 9（KF9）、東農 46（DN46）；高蛋白大豆品種：東農42（DN42）、黑農35（HN35）；秣食豆（MSD）；野生大豆（WS）。其中KF9、DN46、HN35、DN42由東北農業大學農學院提供；秣食豆由東北農業大學動物科學技術學院提供；野生大豆由吉林農業科學院提供。

1.2 總RNA的提取

取不同基因型大豆幼苗幼嫩葉片，采用上海生工UNIQ柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA。

1.3 DNA提取

取不同基因型大豆幼苗幼嫩葉片，采用CTAB法提取DNA[5]。

1.4 反轉錄

采用上海生工AMV第一鏈cDNA合成試劑盒。

1.5 目的基因的PCR擴增

根據GenBank上的大豆GS1基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異引物。以基因組DNA或反轉錄產物為模板，使用LA Taq酶擴增基因序列。

GS1基因引物：

Sense：5′AAGGGTCTTTGCTTGATTTTG 3′

Antisense：5′AACGAGGGAAAGGAATAGAAG3′

1.6 PCR產物的電泳回收

參照上海華舜生物工程有限公司回收試劑盒說明書完成。

1.7 PCR產物的克隆

參照pMD18-T vector試劑盒說明進行連接。大腸桿菌感受態的制備、大腸桿菌的轉化、質粒DNA提取均采用常規方法[6]。

1.8 序列分析

應用Clustal W軟件對所獲得的基因序列進行比較分析，分析不同基因型大豆GS1基因的差異，提取共有序列，并構建分子進化樹。應用DNAMan軟件的Translation功能將基因序列轉變成蛋白質序列。應用NetGene2軟件預測基因外顯子和內含子。應用NCBI在線spidey軟件和DNAMan軟件分析基因外顯子和內含子。

2 結果與分析

2.1 不同基因型大豆GS1基因cDNA序列的克隆

通過RT-PCR擴增，在不同基因型大豆中均可擴增出約1300bp的目的大小GS1基因片段（見圖1）。回收1 300 bp的目的大小GS1基因片段，與pUCm-Tvector連接，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。將篩選到的陽性克隆送交測序。

圖1 GS1基因的擴增Fig.1 Amplification of GS1 gene

2.2 不同基因型大豆GS1基因序列分析

經測序獲得了6個不同基因型大豆的GS1基因序列，應用Clustal W對比程序對這6個基因序列進行比較分析，分析結果見圖2。從圖2可以看出，來自不同基因型大豆的GS1基因序列相似性很高，因此能夠從中提取共有序列，并據此設計Real-time PCR引物，檢測不同基因型大豆GS1基因的表達規律。但是這些GS1基因序列間仍存在顯著的差異，有許多單堿基突變和插入缺失突變。其中非編碼區的差異顯著高于編碼區，并且全部的插入缺失突變都位于非編碼區，不會造成移碼突變。這說明非編碼區在進化過程中的選擇壓力小于編碼區，更易于積累基因突變。編碼區內的堿基置換可能改變其所編碼的氨基酸序列或影響翻譯效率，進而造成酶活性和酶量的差異。由此導致不同基因型大豆氮代謝的差異，最終導致蛋白品質上的差異。值得關注的是，在突變集中的3′端非編碼區，東農42和半野生大豆GS1基因序列表現出極高的相似性，暗示著二者之間可能有著較近的親緣關系。

圖2 不同基因型大豆GS1基因序列比對結果Fig.2 Alignment of GS1 genes sequences from different genotype soybeans

根據不同基因型大豆GS1基因序列，應用Clustal W軟件構建了GS1基因分子進化樹（見圖3）。從分子進化樹中可以看出，東農42、半野生大豆、東農46 GS1基因序列進化距離較近。

2.3 不同基因型大豆GS1 蛋白質序列分析

提取不同基因型大豆GS1基因的編碼區序列（CDS），應用DNAMan軟件的Translation功能將其轉變成蛋白質序列，應用ClustalW對比程序對這6個蛋白質序列進行比較分析，分析結果表明不同基因型大豆GS1蛋白質序列具有很高的相似性（比對結果圖略）。并且NCBI保守結構域數據庫（CDD）檢索結果表明，不同基因型大豆GS1蛋白質序列都具有兩個保守的結構域，催化結構域（Gln-synt_N）和結合結構域（Gln-synt_C），說明它們都具有催化功能（見圖4）。

圖3 不同基因型大豆GS1基因分子進化樹Fig.3 Evolutionary tree of GS1 genes from different genotype soybeans

圖4 GS1 蛋白質保守結構域分析Fig.4 Analysis of conserved domains for GS1 protein

應用Clustal W軟件構建了這6個蛋白質序列的分子進化樹（見圖5），從中可以看出東農46和東農42 GS1蛋白質序列進化距離較近，墾豐9和黑農35 GS1蛋白質序列進化距離較近。盡管東農42和半野生大豆GS1基因序列進化距離較近，但是在蛋白質序列的分子進化樹中二者相距較遠，導致這一差異的原因是二者在GS1基因非編碼區的高度相似性。

圖5 不同基因型大豆GS1 蛋白質分子進化樹Fig.5 Evolutionary tree of GS1 protein from different genotype soybeans

圖6 GS1基因基因組序列的PCR擴增Fig.6 PCR amplification of genomic sequence of GS1 genes

2.4 東農42 GS1基因結構分析

以東農42基因組DNA為模板，用GS1基因特異引物進行PCR擴增，電泳結果如圖6所示，在49.8和52.8℃均可擴增出約4 kb的特異條帶。

經測序獲得了東農42 GS1基因的基因組序列，應用NetGene2軟件預測基因外顯子和內含子，預測結果顯示該基因具有12個外顯子和11個內含子（見圖7）。應用DNAMan軟件的Dot metrix功能對東農42 GS1基因基因組序列和cDNA序列進行比對，可以很直觀地看出東農42 GS1基因cDNA序列完全包含在其基因組序列中，二者形成12個匹配區段，說明東農42 GS1基因基因組序列具有12個外顯子（圖略）。應用NCBI在線spidey軟件對東農42 GS1基因基因組序列和cDNA序列進行比對，同樣可以看出，東農42 GS1基因cDNA序列具有12個外顯子，基因外顯子及其側翼序列的特征都符合GT、AG規則（圖略）。以上分析結果充分證明了東農42 GS1基因具有12個外顯子和11個內含子。

圖7 NetGene2軟件預測GS1基因外顯子和內含子結果Fig.7 Graphics showing the prediction output of GS1 gene using NetGene2 software

3 討論

基因序列的差異影響蛋白質序列，并最終導致酶分子結構和功能的差異，因此研究不同基因型大豆關鍵酶基因序列的差異是闡明大豆品質差異分子基礎的關鍵之一。目前關于氮代謝關鍵酶基因的研究主要集中在GS，大麥、玉米、水稻、豌豆、大豆、苜蓿等許多植物的GS cDNA已被克隆，但做不同基因型間序列比較以及基因組序列克隆和分析的很少。

本研究克隆了不同基因型大豆GS1基因的cDNA，比較了基因序列及其編碼的蛋白質序列的差異，為闡明不同基因型大豆氮代謝差異的分子機理奠定了基礎。但是關于酶分子結構與功能之間的相關性還有待于深入研究。為闡明GS1基因的結構，本研究克隆了東農42 GS1基因的基因組片段。生物信息學分析表明該基因包括12個外顯子和11個內含子，這與Cock等在苜蓿中的研究結果一致，反映了不同物種間同源基因結構的保守性[7]。

酶基因的表達調控是在不同水平上進行的，主要包括：①基因的結構；②mRNA的轉錄和加工；③翻譯；④多肽的亞細胞定位、加工和修飾；⑤酶蛋白多聚體的組裝；⑥酶活性的調控；⑦酶的降解。其中轉錄水平和酶活性水平的調控是關鍵環節[8］。由于不同基因型、不同生育期以及不同部位酶基因mRNA豐度的差異有限，因此對mRNA的精確定量是轉錄水平調控研究的關鍵。以前這方面的研究主要采用Northern雜交方法，不能實現精確定量。Real-time PCR技術的建立和發展使mRNA的精確定量成為可能。本研究比較了不同基因型大豆GS1基因的cDNA序列，發現了其共有序列，為設計通用Real-time PCR引物和探針，在轉錄水平研究不同基因型大豆GS1基因的表達規律奠定了基礎。

4 結論

墾豐9、東農46、東農42、黑農35、秣食豆、野生大豆的GS1基因序列相似性較高，不同基因型大豆GS1基因序列間的差異主要集中在非編碼區，東農42、半野生大豆GS1基因序列進化距離較近。不同基因型大豆GS1蛋白質序列具有很高的相似性，并且都具有兩個保守的結構域，催化結構域（Gln-synt_N）和結合結構域（Gln-synt_C），東農46和東農42 GS1蛋白質序列進化距離較近，墾豐9和黑農35 GS1蛋白質序列進化距離較近。東農42 GS1基因具有12個外顯子和11個內含子。

[1]Paula M M,Ligia M L,Isabel M S，et al.Expression of the plastidlocated glutamine synthetase of Medicago truncatula[J].Plant Physiology,2003,132(1):390-399.

[2]李常健,林清華,張楚富.高等植物谷氨酰胺合成酶研究進展[J].生物學雜志，2001，18(4):1-3.

[3]劉麗君，孫聰姝.氮肥對大豆結瘤及葉片氮素積累的影響[J].東北農業大學學報，2005，36（2）：133-137.

[4]孫太靖，龔振平，馬春梅.大豆植株氮素積累與轉運動態的研究[J].東北農業大學學報，2004，35（5）：517-521.

[5]代翠紅，李杰，朱延明,等.不同提取方法對4種重要作物提取效率的比較[J].東北農業大學學報，2005，36（3）：329-332.

[6]薩姆布魯克.分子克隆實驗指南[M].3版，北京：科學出版社，2002.

[7]Cock J M,Brock I W,Watson A T,et al.Regulation of glutamine synthetase genes in leaves of Phaseolus vulgaris[J].Plant Mol Biol,1991,17:761-771.

[8]Suzuki A,Knaff D B.Glutamate synthase:Structural,mechanistic and regulatory properties,and role in the amino acid metabolism[J].Photosynthesis Research,2005,83:191-217.