幽門螺桿菌活載體疫苗的研究進展＊

羅夙醫,吳利先

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H P)被公認為是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍等疾病發生的主要病因,并與胃腺癌、胃淋巴瘤的發生密切相關,是一級致癌因子[1]。雖然H P確切的致病機制尚未完全闡明,但H P必須首先定植于胃粘膜,然后再進一步侵入宿主防御系統,由其毒素的直接作用和誘導的炎癥反應等間接作用損傷組織而致病。流行病學調查研究顯示,我國幽門螺旋桿菌感染率約為40%～60%,兒童也有相當高的感染率。雖然聯合化學藥物治療對H P感染可取得較好的根除率,但也存在菌株耐藥、藥物副反應、價格昂貴等問題,難以推廣。因此,人們期待H P疫苗的早日問世。很多實驗證明,減毒菌株能有效激發機體產生免疫應答。將限制性突變引入減毒菌,可使其變得更安全,所以減毒胞內菌已被許多科研工作者用作載體攜帶外源抗原,即活載體疫苗[2]。接種這種重組活疫苗后,能同時獲得對病原體本身的防御作用和異源抗原的特異性免疫應答。因此,在使用多種疫苗載體攜帶抗原激起黏膜免疫途徑的方法中,活菌作為疫苗載體具有相當好的應用和開發前景。下面就H P活載體疫苗的研究近況進行綜述。

1 減毒沙門菌作為活載體的疫苗

減毒沙門氏菌是最早用做活疫苗載體的病原菌之一,也是目前研究最深入的活菌疫苗載體。最適合表達異源性抗原的是鼠傷寒沙門氏菌。它在人體內的感染局限于腸黏膜,但在小鼠體內可以廣泛感染。減毒沙門氏菌載體的構建策略是使致病基因缺失,然后將外源基因整合到沙門氏菌染色體的特定部位。構建鼠傷寒沙門氏菌活載體減毒株,均是兩個或多個基因的精確突變,其基因型和表型均很穩定。

我國陳旻湖等[3]成功構建了表達幽門螺桿菌(H P)過氧化氫酶(Kath)的減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株,并將此減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株經口服接種C57BL/6小鼠,再用H P悉尼株(SS1)進行攻擊,然后對胃組織標本進行快速尿素酶試驗和細菌定量培養,結果均顯示,該疫苗株具有防御感染的作用,特別是以3×108CFU/只的菌量接種時獲得的效果最佳,提示重組減毒沙門氏菌疫苗株在動物體內能夠誘導出抗H P保護性免疫效應。隨后他們還構建了表達尿素酶B亞單位(UreB)與血溶素 E(hlyE)融合蛋白的減毒沙門疫苗菌也取得了同樣的效果[4]。Xu等[5]構建了共表達幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和小鼠IL-2的減毒傷寒沙門氏菌活載體疫苗,通過Western blot證實此融合蛋白具有免疫原性。通過小鼠體內試驗證實此融合基因活載體疫苗具有抗幽門螺桿菌感染的作用。Sun等[6]構建了表達幽門螺桿菌中性粒激活蛋白(napA)的減毒沙門氏菌活載體疫苗,也通過Western blot證實了此疫苗表達的中性粒激活蛋白具有抗原性。動物試驗證實此疫苗具有免疫原性。此外,還有減毒鼠傷寒沙門氏菌作為載體,表達螺桿菌粘附素基因HpaA,尿素酶A亞單位為靶基因的活載體疫苗報道[7-8]。

減毒沙門菌載體疫苗免疫簡單易行,一次口服免疫可誘導較強的免疫保護反應,有利于大規模接種,且減毒沙門菌既是外源抗原的載體又可作為疫苗佐劑;以減毒沙門菌載體疫苗免疫具有持續性和多聯性,能激發比較全面的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫反應,其抗原遞呈效率高于以往其他的DNA疫苗。但制備疫苗用菌株仍存在微弱的致病性。

2 乳酸菌為活載體的疫苗

乳酸菌(lactis acid bacteria,L AB)被公認為安全級(generaly recognized as safe,GRAS)微生物。廣泛分布于環境,特別是動物的消化道、尿道,蔬菜和食品中,具有調節腸道菌群、預防或緩解胃腸道疾患、增強機體免疫功能、減少心血管病發病率、降低與酒精中毒性肝病相關的內毒素作用等有益于人體健康的諸多生理功能[9]。

有研究表明,乳酸桿菌可以某種免疫調節因子的形式起作用,刺激胃腸道某種局部型免疫反應。說明乳酸桿菌不僅可以預防和治療H P感染,還可抑制其他致病菌的生長,同時不會對胃酸過度抑制,故以乳酸桿菌為主的微生態制劑可能成為一種安全、有效的治療H P感染的方法。同時也可能成為一個較理想的H P疫苗的載體。

我國孫振璐等[10]將H P的alpA基因克隆至表達載體pNICE:sec,并將其轉化入乳酸菌NZ9000株,在乳酸菌中成功表達了H P的黏附素alpA蛋白。Western blot顯示alpA蛋白具有良好的免疫原性。將表達alpA蛋白的乳酸菌NZ9000株免疫小鼠后有抗體產生,說明表達alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,有防御幽門螺桿菌感染的作用。李建芳等[11]將 napA基因克隆到乳酸菌表達質粒pNICE:sec,在乳酸菌中實現表達。經活菌灌胃免疫小鼠,實驗證明獲得的活載體疫苗對小鼠有保護作用。于文等[12]在以幽門螺桿菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20為目的基因,分別構建了乳酸乳球菌表達重組載體 PNZ8112/ureI和PNZ8112/lpp20。該攜帶質粒的活菌在傳代二十代后其質粒未丟失,證明該重組質粒具有良好的穩定性,為進一步研究其免疫保護作用奠定了基礎。龔芳紅等[13]構建了含H P熱休克蛋白A(HspA)編碼基因的重組載體,并電轉化入乳酸球菌MG1363,表達目的蛋白并分析其免疫原性,成功構建了表達H PHspA的重組乳酸乳球菌 MG1363。朱麗芳等[14]構建高效表達幽門螺桿菌黏附素H P0410的嗜酸乳桿菌重組菌株,也成功構建了高效表達H P0410的重組嗜酸乳桿菌菌株。

3 分枝桿菌為活載體的疫苗

卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)一度認為是理想的重組活載體疫苗。但近10年的研究表明,BCG有諸多不足:難于培養,對多種抗生素有抗藥性,轉化率低,對于免疫力低下者,有可能誘發致命的結核病,許多學者轉向非致病分枝桿菌作為載體的研究。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS)是一類快速生長型分枝桿菌,生長快,1～3h繁殖1代,MS既是一種非致病菌又是一種細胞免疫佐劑,很多外源蛋白能在MS中表達。我國向廷秀等[15-16]選擇H P兩個保守基因 UreB和OMP18分別克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體中,利用電穿孔法將表達載體導入MS中,然后將重組候選疫苗株單獨或聯合灌胃免疫BALB/c小鼠。攻擊后4w,取血清、胃、脾組織,RT-PCR檢測小鼠胃粘膜和脾組織的 Th1細胞因子(INF-γ、IL-2、IL-12)與 Th2 細胞因子 (IL-4、IL-6、IL-10);ELISA檢測H P特異性血清 IgG,IgG1,IgG2a和IgA水平;免疫組化方法檢測胃黏膜固有層IgA表達;MTT檢測淋巴細胞增殖。提示該疫苗的作用機制是誘導 Th1/Th2平衡型免疫應答。徐永柱等[17]構建了UreB基因質粒pLUB大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質粒和重組恥垢分枝桿菌疫苗,重組MS疫苗經灌胃接種BALB/c小鼠能降低H P定植,減輕胃黏膜的炎癥反應,對H P感染有明顯的預防保護作用。呂琳等將H P外膜蛋白Omp26基因克隆入大腸桿菌一分枝桿菌穿梭表達載體中,用與向廷秀相同的方法獲得了活載體疫苗。用活菌免疫小鼠后再用幽門菌攻擊小鼠,結果顯示,rMs治療性疫苗不僅能明顯減少小鼠胃粘膜H P數量,甚至可根除胃內H P的感染,而且能減輕胃黏膜的局部炎癥反應,能產生以 Thl細胞和 Th2細胞反應協同作用的保護性免疫應答。隨后他們又構建了幽門螺桿菌尿素通道蛋白UreI基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質粒,并在恥垢分枝桿菌中獲得表達[18]。然而不同的實驗動物、不同的免疫途徑、不同的疫苗載體可產生不同的免疫效果,免疫機制也有所不同,需進一步對感染機制及疫苗保護機制進行研究。

MS與固有免疫抗結核分枝桿菌(M ycobacterium.tuberculosis,Mtb)都是胞內寄生菌,進入機體被巨噬細胞吞噬,具有一定的靶向性。MS具有較強的Th1細胞免疫佐劑作用。MS經分子生物學技術改造后,作為外源基因的表達或遞送載體。與其他載體相比,具有良好的安性、靶向性和易控性,價格低廉,易于推廣。恥垢分枝桿菌不能在巨噬細胞內長期存活,從基因治療的角度出發,單位細胞內攝入的重組MS數量越多,則通過該菌苗帶入巨噬細胞內的基因治療性質粒的拷貝數越多,對于表達 GLS和IL-12就越有利。

4 以雙歧桿菌為活載體

雙歧桿菌是存在于人體腸道內一種非常重要的益生菌,能代謝產生多種活性物質。研究表明,雙歧桿菌對人類的健康起著重要的作用,不僅可治療腸道菌群失調、抗菌消炎、調節免疫、輔助治療多種疾病,還具有抗輻射和作為基因治療轉移載體、抑制腫瘤等多種功效。

雙歧桿菌做載體在寄生蟲和腫瘤領域應用比較多。用在幽門桿菌疫苗方面較少,但應該也是一種較為可行的載體,本課題組正致力于此方面的研究。

5 其它的 HP疫苗載體

其它的活載體疫苗有病毒載體疫苗、自載體疫苗。Novak等[19]曾將H P脲酶亞單位基因插入減毒脊髓灰質炎病毒的基因中,代替部分脊髓灰質炎病毒使小鼠產生抗H P脲酶亞單位的IgG抗體,并且能夠誘導產生 IFN-γ和 IL-4。以病毒作為疫苗傳遞載體的研究為近年來興起,但作為H P疫苗的載體研究報道較少,研究范圍和深度尚待進一步加強。1999年 Panthel等[20]通過 PhiX174基因 E介導的細菌溶解機制,使H P變為一個細菌空殼,實現了一種新形式的幽門螺桿菌全菌疫苗,免疫小鼠能產生高效的局部和系統免疫反應,動物試驗中能夠有效根除感染的H P,亦能有效控制再次感染。

6 展 望

研究安全無毒、效果明顯、便于生產和應用的疫苗是H P疫苗研究的最終目標,活載體疫苗具備了其他形式疫苗所不具有的眾多優點,必將在未來得到更加廣泛深入的研究,會成為H P疫苗未來的主要發展方向。幽門螺桿菌載體疫苗的發展將還有一段艱難的道路,特別是需要解決一系列關鍵技術。如目前免疫效果最好的減毒沙門菌載體疫苗,在志愿者試服過程中出現了較強烈的嘔吐、腹瀉等毒性反應,在廣泛人群中應用的可能性還很小。技術最新的“細菌幽靈疫苗”,目前僅在實驗室研究階段,缺乏大量的免疫、毒理及其他一系列保護性和安全性試驗數據.而且作為基因工程疫苗,同乳酸菌載體疫苗一樣,攜帶有轉基因成分的疫苗和載體疫苗不但要解決食品級疫苗改造的技術難關,在安全性評價、工業化生產和群眾認可度上也存在很多未知因素,需要進一步探索和求證。

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