雞卵黃抗體(IgY)的性質、提純及應用于寄生蟲學的研究

周 彥(綜述),沈定文(審閱)

免疫學IgY技術是近幾年發展起來的一種新的生物技術領域及醫藥研究中的熱點技術。本文簡要綜述雞卵黃抗體(IgY)的特性、提純及應用于寄生蟲病免疫診斷及免疫治療等方面,以開拓寄生蟲病防治。

弓形蟲病(toxoplasmosis)危害嚴重,感染方式多種多樣,常規檢測方法包括免疫學檢測、分子生物學檢測及病原學檢測等。病原學培養和動物接種操作復雜,卻是弓形蟲檢測的金標準。現代PCR方法對實驗室條件要求較高且具有經過嚴格訓練的專門技術人員才可上崗。傳統的血清學方法,雖然在區分現癥和既往感染及診斷免疫缺陷患者方面有缺陷,但其操作簡單,仍然是各實驗室的首選方法。有研究表明[1],IgY可應用于弓形蟲病防治且抗體效價高、特異性強、純度高。鑒于此,IgY作為新近研究的免疫診斷抗體是完全可行的,IgY技術在弓形蟲病防治中越來越受到重視。

1 卵黃抗體(IgY)的性質

研究證實[2],產蛋雞的卵黃對抗體有濃集作用,可使其不斷儲存于卵黃中,這種抗體稱為卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk,IgY)。經特定抗原免疫后的母雞可產生相應的特異性抗體,進而進一步應用于疾病診斷及防治中。

Wilmar Dias da Silva等[3]報道,IgY與哺乳動物來源抗體相比較在免疫診斷及免疫治療方面具有以下優勢:

1.1 產量高 成年母雞血清中IgY大約為5-7mg/mL。一只高產蛋雞每月能產20個雞蛋,每月可獲2g IgY,相當于300mL血清中IgY的含量及600mL全血中IgY的含量。生產等量的抗體只能通過大型哺乳動物制得。因此,雞卵黃抗體應用于免疫診斷方面更加經濟。使用少量的抗原免疫禽類既可獲得大量的質量均一的特異性IgY。

1.2 不發生交叉血清反應 由于種系距離相差很大,禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發生交叉血清學反應。雞來源的免疫試劑比哺乳動物來源的試劑要好而且經濟。

1.3 獲取抗體簡單 IgY無需采血,只需收集免疫母雞產下的雞蛋即可獲得抗體。傳統的哺乳動物來源的抗體搜集需通過繁雜的注射及免疫表達過程,且需要在常規間隔時間內收集血清。IgY大大簡化了這一流程[4]。

1.4 假陰性或假陽性率低 雞卵黃抗體不激活哺乳動物的補體系統,不與細菌或哺乳動物的Fc受體結合,不活化樣品中內源性的補體系統,不與類風濕因子或Fc受體相結合,從而避免在免疫檢測過程中產生假陰性或假陽性結果[5]。

1.5 性質穩定 需冷藏,耐酸,巴氏滅菌溫度下也不會失活并且在pH值小于3時仍能保持穩定活性。黃清松[6]等通過ELISA檢測IgY對溫度、酸堿度的穩定性,結果表明IgY具有良好的熱穩定性,對酸堿具有一定的耐受力。免疫印跡表明IgY與雞血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。阮光萍等,用斑點 ELISA快速研究雞卵黃抗體 IgY的理化性質,結果顯示IgY有很好的耐熱性,巴氏消毒不會使 IgY失活 。卵黃抗體在pH＞5和＜9的環境下,37oC 3h后仍保持部分活性。卵黃抗體在室溫存放4個月后仍保持部分活性。在pH＜5時,胃蛋白酶能發揮作用,使卵黃抗體失去活性。

1.6 特殊抗體形成率高 Galtstein和Hemmeler指出,在一個月內收集的雞蛋提純IgY產量比兔血清高18倍。因為IgY的含量高,產量大,可用于替代兔或羊等動物血清。

2.7 起到預防及輔助治療的作用 通過口服特異性抗體IgY,作用于病原體,以達到預防與治療口腔及消化道感染性疾病的目的,尤其對那些不能產生主動應答的個體,如新生兒、有獲得性免疫缺乏癥的兒童、以及由于化學治療、營養失調或老年化引起免疫功能下降的人等具有一定的保護作用。

除此之外,IgY還具有如下性質:比起從哺乳類動物提取的抗體更加安全衛生。對哺乳動物抗原的反應度(sensitivity)高。雞免疫7～10d后在雞卵黃中就產生了抗體。能夠迅速應對暴發性疾病(產生特殊抗體)等。

2 IgY提純

2.1 IgY的提取方法 近年來,已建立多種IgY的分離純化方法,包括:水稀釋法(WD)、硫酸銨沉淀法、聚乙二醇法、葡聚糖硫酸鹽法、黃原膠法、冷乙醇分級分離法、水稀釋超濾法等。

G.Bizhanov等比較了葡聚糖藍法與其他兩種方法(聚乙二醇和氯仿抽提法),結果顯示這三種方法提取的IgY含量大致在log212.9-14.1,即4.6-12.8 mg/egg。氯仿抽提法獲得的總蛋白含量2-4倍于其他兩種方法。SDS-PAGE顯示,葡聚糖藍法可見三條主帶(分子量分別為 34.7kDa、41kDa、66kDa)和一條副帶(分子量為45kDa)。用氯仿抽提的IgY可見兩條主帶(分子量分別為45.7kDa、75.2kDa)。用 PEG-6000提取的 IgY可見一條主帶(分子量為66kDa)。

Ismael Marcet[7]等提出了聚乙二醇法(PEG),其卵黃用2倍體積緩沖液稀釋后,采用8.5%、12%PEG兩次沉淀,重新溶解后用 Tris-HCl沉淀,得4.8±0.8mgIgY/mL卵黃。

Cláudia Maria Costa de Almeida 等[8]報道的水稀釋法,稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大,以此作為提取蛋白的一種方法稱水稀釋法[9]。將卵黃用蒸餾水水稀釋10倍后,調節pH值至5.5,4℃放置6h以上,可以有效得到WSF(水溶性片段water-soluble fraction)。含IgY的上清液在10 000×g離心30min、經飽和硫酸銨純化,IgY產量達9.8 mg/mL卵黃,回收率達91%。

任平國等[10]采用的有機物沉淀法。其原理為:一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶于水、稀鹽溶液或堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提脂蛋白的提取液。其工藝流程為:卵黃→8倍水稀釋并攪10min→用HCl調pH至5.2后在4℃靜置2h去沉淀→在上清液中加入95%冰乙醇(-20℃)使終濃度為60%(v/v)→4℃攪拌20min后離心(22 000r/min,4℃,25min)→收集沉淀并加入0.028mol/LNaCl溶液在4℃下過濾除去脂蛋白沉淀→收集的濾液用SDS-PAGE法進行純化得純度為98%的IgY。用大腸桿菌(E.coli)對其活性進行測定,效果良好,此方法能保持免疫球蛋白的活性。

2.2 IgY純化方法

主要采用層析技術。層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異(如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等),使各組分在兩相(一相為固定的,稱為固定相;另一相流過固定相,稱為流動相)中的分布程度不同,從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。最常用的方法為凝膠層析和離子交換層析。

Hamajima[11]用 DEAE-sephacel層析柱純化IgY純度達 98%,產量為70～100rag/卵。Hansen[12]使用親硫作用層析純化IgY。其原理為:此種親硫層析的吸附劑中包含有2-巰基乙醇與二乙烯砜反應的活性支持物,稱為T膠。能在高鹽環境下選擇性地結合免疫球蛋白,因而可用于純化IgY。

不少學者還使用超濾法進行IgY純化。其原理為:超濾法使用多孔纖維超濾膜進行過濾,這種濾膜只容許小于100kDa的分子通過。IgY的分子量在200kDa左右,因而不能通過被留下。Akita在多次沉淀WSF后使用超濾法,Ntakarutimana在使用親和層析提取IgY后再利用超濾膜過濾,均起到進一步純化IgY的作用。

Dexian Dong[13]等,為尋找最適配體,用按照最大區分度配體標準的選擇出來的240柱配體連接膠體去粘合IgY。每組實驗包括24配體聚苯乙烯柱。使用此配體的IgY純度可達92.1%,回收率可達78.2%。

3 IgY應用前景

3.1 疾病免疫診斷 Kerstin Greunke[14]等報道,IgY可作為檢測或捕獲抗體檢測傳統的哺乳動物免疫球蛋白,具有更高的靈敏性和精確性。施強,李婷婷報道,用IgY作為第I抗體,間接酶免疫染色,檢查細胞內弓形蟲速殖子,具有特異性。沈榮等報道,用純化的弓形蟲蟲體抗原免疫白萊杭雞獲得特異性的IgY抗體,以辣根過氧化物酶標記后與抗人IgM單抗配伍建立捕獲法酶免疫試驗,與同類試劑對照,平行檢測192份臨床樣本,檢測結果二者吻合。

3.2 疾病治療 李慶昌等報道,從人胃低分化粘液腺癌細胞MGC803中分離出一種癌蛋白P110,并以此蛋白P110為抗原免疫產蛋母雞,再從免疫過的雞蛋卵黃中分離出對人低分化粘液腺癌細胞具有選擇性識別作用的抗體IgY,再與蓖麻毒蛋白的A鏈偶聯成IgY-RicinA免疫毒(生物導彈),并對體外培養的癌細胞具有選擇性和殺傷能力。結果顯示:用IgY-RicinA免疫毒治療TA小鼠S-78-4腫瘤獲得較好的效果,治愈率達84%。臨床應用IgY-RicinA治療上消化道中晚期惡性腫瘤30例,有效率達79.9%,治療前后肝腎功能及血象檢查無異常變化,而且治療后未發現毒副反應。生物導彈IgY-RicinA治療上消化道腫瘤有一定的作用,是一種很有發展前途的制劑。

Chao-Yang Fu[15]等報道,使用水純化法制得抗SARS冠狀病毒的IgY,經G-75柱進一步純化之后,制得的 IgY有較高的純度,再經SDS-PAGE、western blot分析,其反應活性效價為1∶640。凍干法和穩定性測試顯示,抗SARS冠狀病毒IgY具有很有發展前途的物理特性,反應活性不減低,有較好的化學穩定性。所有數據表明,抗SARS冠狀病毒的IgY可以作為特定的抗病毒治療SARS的一種新興生物制品。

3.3 發現藥物靶點 Wei-Wei Zhang報道,IgY是一類免疫球蛋白,與常規使用的 IgG相比更具特點。特定基因型的IgY抗體能夠應用于發現及檢測生物芯片中的藥物靶點。

3.4 食品檢測 Zhao-Hui DUAN[16]等報道,SDSPAGE顯示抗桔霉素IgY純度較高且分子量在1000KD左右。間接ELISA顯示,IgY用于檢測桔霉素的閾濃度為 10ng·mL-1,在20～640 ng·mL-1有很好的線性關系。

Chao-Cheng Chen[17]等報道,通過大腿肌內注射雞獲得抗牛奶堿性磷酸酶的免疫球蛋白IgY,并把這種抗體作為引導競爭性間接酶聯免疫吸附實驗(CI-ELISA)檢測奶粉(BM)及大腸桿菌來源的奶粉堿性磷酸酶(BMALP)的一抗。CI-ELISA證實此法能夠有效區分奶粉堿性磷酸酶及結腸堿性磷酸酶,并對全脂奶粉及脫脂奶粉的結腸堿性磷酸酶的活性為0.6U/mL的情況下進行定量。

3.5 其他

3.5.1 乳牙防齲:王祝玲,王強[18]報道,應用抗齲IgY牙膏6個月后,實驗組、對照組間發病率、新增齲均、新增齲面均無顯著性差異(P＞0.05);1年后,實驗組與對照組間新增齲均、新增齲面均有顯著性差異(P＜0.05);18個月后實驗組與對照組間的發病率、新增齲均和新增齲面均有顯著性或極為顯著性差異(P＜0.01),實驗組明顯低于對照組。抗齲IgY牙膏的應用能降低乳牙齲病的發病率及新增齲均、齲面均具有一定的防齲效果,有較好的應用前景。

3.5.2 抗病毒:Peter T.Witkowski[19]等報道,由于從雞蛋收集的抗體可產生大量非侵略性抗體。為減少其攻擊性,使用原始形態的蛋白免疫來逃避先前的蛋白表達和純化。用DNA表達載體免疫雞,收集雞蛋并提純制得抗痘病毒的IgY。

3.5.3 抗細菌:張文平等報道,分離人陰道上皮細胞,用抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌對陰道上皮細胞預處理后進行白色念珠菌黏附抑制試驗;建立小鼠白色念珠菌性陰道炎模型,通過陰道局部給抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌來觀察療效。結果顯示,抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌均能抑制白色念珠菌黏附陰道上皮細胞,并能減少白色念珠菌在小鼠陰道內的定植和減輕小鼠陰道局部的炎癥反應。

3.5.4 抗生育:精子具有免疫原性在一個世紀以前已為人所知,某些特異性抗體與精子抗原結合可影響精子的運動或獲能、干擾精卵結合等從而引起不育也為人所證實,故這些抗精子抗體具有開發成避孕藥具的潛在可能[20]。呂年青等用人全精子抗原來免疫產蛋母雞,從卵黃中獲得了大量特異性的抗人精子IgY,并發現這些抗精子IgY可以使人類精子凝聚,提示抗精子IgY有可能成為未來極有潛力的候選避孕藥具。

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