快速鑒定格爾德霉素產生菌——吸水鏈霉菌17997中的洋橄欖葉素

李書芬，武臨專，陳菲菲,2，王紅遠，孫桂芝，王以光

1 中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫藥生物技術研究所 衛生部抗生素生物工程重點實驗室，北京 100050

2 中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所，成都 610052

在對格爾德霉素 (Geldanamycin，GDM；一種苯醌型安莎類抗生素) 產生菌吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的次級代謝產物進行研究時，發現其發酵上清液具有抗革蘭陽性菌活性[1]。格爾德霉素具有抗真菌活性，但不具有抗革蘭陽性菌活性。萘安莎類抗生素如利福霉素(Rifamycin)、萘霉素 (Naphthomycin) 和紅迪菌素(Rubradirin) 等，具有顯著的抗革蘭陽性菌活性。在吸水鏈霉菌17997的基因組DNA中存在可能負責萘安莎類抗生素生物合成的基因[1-3]，因而曾經推測該菌株具有萘安莎類抗生素產生潛能，但是該推測始終沒有得到證實。

本研究對吸水鏈霉菌 17997產生的一個具有抗革蘭陽性菌活性化合物進行了快速鑒定，確證為洋橄欖葉素 (Elaiophylin；又稱阿沙霉素B，azalomycin B；化學結構見圖1)，具體報道如下。

圖1 洋橄欖葉素化學結構Fig. 1 Chemical structure of elaiophylin.

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：吸水鏈霉菌17997，GDM產生菌；枯草芽胞桿菌 63501，革蘭陽性檢定菌；上述菌株均為本實驗室保藏。

培養基：ISP2培養基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1.0%，葡萄糖0.4%，瓊脂粉1.8%。液體發酵培養基：淀粉2%，棉子餅粉0.5%，葡萄糖0.5%，玉米漿1.0%，酵母粉0.5%，CaCO30.2%。生物檢定培養基：蛋白胨0.6%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.2%，pH 7.2。

試劑：酵母提取物 (Yeast extract)、麥芽提取物 (Malt extract)，英國Oxoid公司產品，葡萄糖為國產分析純試劑。TLC硅膠板 (GF254)，山東煙臺吉德精細化工有限公司或青島海洋化工分廠產品。乙酸乙酯 (EtOAc)、甲醇、二氯甲烷、環己烷等有機溶劑為北京化工廠分析純試劑。洋橄欖葉素對照品由中國科學院成都生物研究所李國友博士惠贈[4]，以及澳大利亞 Bioaustralis 公司產品。PCR引物及相關試劑由寶生物工程 (大連) 有限公司合成或提供。

1.2 方法

吸水鏈霉菌 17997的培養與發酵：新鮮的吸水鏈霉菌 17997孢子斜面 (ISP2培養基，28 ℃培養7~10 d，挖塊接種于液體發酵培養基，28 ℃振蕩(200 r/min) 培養48~96 h。發酵液離心后，棄沉淀；發酵上清液用于乙酸乙酯 (EtOAc) 提取分析等。

EtOAc提取：取吸水鏈霉菌17997發酵上清液25 mL，用等體積EtOAc萃取，傾出EtOAc萃取液，室溫吹干，復溶于約0.5 mL EtOAc中。

硅膠板TLC分離檢測以及NaOH顯色：取上述20 μL EtOAc提取物濃縮液，硅膠板TLC初步分離，在EtOAc∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇 (9∶6∶6∶2，V/V/V/V) 溶媒系統中展開后，用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂 (一種針對格爾德霉素及其生物合成類似物的顯色方法[5])，照相記錄。

抗革蘭陽性菌活性檢測：將上述 TLC硅膠板(沒有用NaOH溶液噴涂顯色) 貼到含枯草芽胞桿菌63501的生物檢定培養基平板上約1 min，揭去硅膠板，將平板置于37 ℃培養16 h，平板上透明帶對應的硅膠板條帶含有抗革蘭陽性菌活性化合物。

HPLC和LC-MS：將硅膠板上含有抗菌活性化合物的條帶用EtOAc洗脫下來后，吹干，復溶于少量甲醇中，進行HPLC和LC-MS分析。HPLC分析：Dikma Diamonsil C18反相色譜柱，(5 μm，150 mm× 4.6 mm)；20%~100%甲醇梯度洗脫，30 min；流速1 mL/min；檢測波長256 nm。LC-MS分析：Agilent 1200液相色譜系統與 Applied Biosystems/MSD SCIEX (Concord，Ont，Canada) 公司的Qstar LC-MS質譜儀聯用，配有Turbo Ionspray離子化源。液相色譜條件同HPLC。質譜檢測條件：噴霧電壓5.5 kV；溫度450 ℃；解簇電壓80 V；霧化氣40相對單位，輔助氣30相對單位，均為氮氣；全掃描監測，正離子方式，質荷比 (m/z) 范圍為 100~1 300；采用信息依賴掃描模式獲得二級質譜；碰撞壓力設為高；碰撞能量為50eV。

dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因保守區的 PCR擴增：上游引物P1序列5′-GSGGSGSSGCSGGSTTC ATSGG-3′，下游引物P2序列5′-GGGWRCTGGYRS GGSCCGTAGTTG-3′[6]；其中，R=A/G，W=A/T，Y=C/T，S=C/G。吸水鏈霉菌17997總DNA (PCR模板) 提取，微波法[7]；使用寶生物工程 (大連) 有限公司Taq LA聚合酶、GC Buffer I進行PCR，PCR主要參數為：96 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環。

2 結果與討論

2.1 抗菌活性化合物的HPLC分析

在對吸水鏈霉菌 17997次級代謝產物分析時，發現一條在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的條帶 (圖 2)。抗菌活性分析顯示：該紅色條帶所對應的化合物 (未顯色) 具有抗革蘭陽性菌活性。將該條帶所含化合物從硅膠板上洗脫下來后進行HPLC分析，出現一個顯著的洗脫峰，其紫外吸收峰形與保留時間均與文獻報道的洋橄欖葉素基本一致[8-9]。有報道在格爾德霉素產生菌的次級代謝產物中發現洋橄欖葉素[9-10]。

圖2 吸水鏈霉菌 17997發酵液乙酸乙酯提取物經 TLC硅膠板分離后用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂顯色結果Fig. 2 Color reaction by spraying 2.0 mol/L NaOH onto the TLC silica gel of EtOAc extract of the fermentation supernatant of Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖3 吸水鏈霉菌17997所產生的抗革蘭陽性菌活性化合物的HPLC譜圖Fig. 3 HPLC profile of the compound with anti-Gram positive bacteria activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

對吸水鏈霉菌17997菌絲體用丙酮浸泡提取和分析后，發現更多的NaOH溶液噴涂顯紅色化合物，這與洋橄欖葉素作為次級代謝產物主要存在于菌絲體內的報道相符合[11]。將該化合物與洋橄欖葉素對照品混和后進行HPLC分析，二者的保留時間和紫外吸收峰形一致；洋橄欖葉素對照品在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯示相同的紅色。因此，該化合物很可能是洋橄欖葉素。

2.2 吸水鏈霉菌17997基因組DNA含有洋橄欖葉素dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶 (Tgd) 基因

洋橄欖葉素化學結構中含有 2-脫氧-L-巖藻糖(2-deoxy-L-fucose) 組分。已知葡萄糖通過磷酸化、dTDP化、脫水、還原、差向異構化等反應生成 2-脫氧-L-巖藻糖，再經糖基轉移酶催化進入到洋橄欖葉素分子中；2-脫氧-L-巖藻糖的生物合成需要Tgd[12]。采用tgd基因保守區設計的引物，以吸水鏈霉菌17997基因組DNA為模板，PCR得到一條預計大小 (約0.6 kb) 的特異性DNA條帶 (圖4)。對該 DNA條帶進行測序 (GenBank Accession No. HQ260658)，它所編碼的氨基酸序列，與美國專利US 7595187報道的洋橄欖葉素生物合成基因簇中dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因 (EMBL Accession No. GP697132) 保守區編碼氨基酸序列幾乎完全相同 (Identities=154/158 (97%)，Positives=156/158 (98%)，Gaps=1/158 (0%))[13]，從而確證PCR擴增的 DNA片段屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中的tgd基因保守區。吸水鏈霉菌17997中存在洋橄欖葉素tgd基因，提示其具有產生洋橄欖葉素的遺傳基礎。

2.3 抗菌活性化合物與洋橄欖葉素具有相同的LC-MS譜

圖4 PCR擴增吸水鏈霉菌17997中的tgd保守區Fig. 4 PCR amplification of the conserved region of tgd from Streptomyces hygroscopicus 17997. 1: DNA marker; 2: the conserved region of tgd (600 bp) from Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖5 吸水鏈霉菌17997中產生的抗菌活性化合物的二級MS譜圖Fig. 5 The MS2 profile of the compound with antibacterial activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

為了確證吸水鏈霉菌 17997中的抗革蘭陽性菌活性化合物為洋橄欖葉素，對其進行了LC-(+)-ESIMS分析 (圖5)：MS1顯示一個m/z=1 047.7的加合離子 ([M+Na]＋)，其MS2主要碎片離子為m/z=729.4和 411.2。已知洋橄欖葉素的分子式為 C54H88O18，精確分子質量 1 024.60。該化合物與文獻所述的洋橄欖葉素MS1和MS2結果一致[14]。其中，m/z=729.4碎片離子系分子丟失兩個 2-脫氧-L-巖藻糖組分形成，m/z=411.2碎片離子系分子的內酯環組分進一步脫水形成。因此，該抗菌活性化合物被證實為洋橄欖葉素。

3 討論

吸水鏈霉菌是鏈霉菌屬中的一個比較常見種。據不完全統計，吸水鏈霉菌能夠產生100多種不同的次級代謝產物；此外，同一菌株產生一種以上不同化學結構的抗生素并不少見。洋橄欖葉素是一種大環二內酯類抗生素，在雷帕霉素 (Rapamycin)、尼日利亞菌素 (Nigericin) 和除莠霉素 (Herbimycin) 等抗生素產生菌 (屬于吸水鏈霉菌) 的次級代謝產物中均發現了洋橄欖葉素[15-16]。

近年來，對微生物次級代謝產物、特別是抗生素的生物合成機制有了越來越多的研究和認識，并積累了大量的抗生素生物合成基因 (簇) 序列信息。基于特定生物合成必需基因的保守序列設計寡核苷酸引物，通過PCR可以快速篩選潛在的具有特定化學結構特點的抗生素產生菌[17-19]；再通過序列分析與比對，可以為推測菌株可能產生的抗生素化學結構或類型提供重要的提示或參考。本文通過證實吸水鏈霉菌17997含有dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，并通過序列分析表明它屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中與2-脫氧-L-巖藻糖生物合成相關的dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，提示該菌株具有產生洋橄欖葉素的遺傳基礎，為推測抗革蘭陽性菌活性化合物為洋橄欖葉素提供了重要的參考。

洋橄欖葉素具有抗革蘭陽性菌、抗線蟲、抗原生動物、免疫抑制和抗哺乳動物腫瘤細胞等多種生物學活性；在基于單純的生物活性篩選模式的微生物次級代謝產物研究中，被重復發現 (分離純化和化學結構解析) 多次。本文報道了洋橄欖葉素及其產生菌的一種快速、簡易鑒定方法；其中，洋橄欖葉素在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的特性屬于首次報道，其ESI(+)-MS2譜圖是首次公開給出，適用于洋橄欖葉素類化合物及其產生菌的早期快速鑒別和排重。洋橄欖葉素用NaOH溶液處理顯紅色的原理，推測是由于分子中的內酯鍵在堿性條件下發生水解后分子再脫水增加一個共軛雙鍵，以及分子生成鈉鹽所致。

致謝：中國科學院成都生物研究所李國友博士惠贈洋橄欖葉素對照品。中國醫學科學院藥物研究所分析中心完成LC-MS分析。

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