工業生物技術專刊序言

蔡真，李寅

中國科學院微生物研究所，北京 100101

進入 21世紀以來，礦石資源和能源的不斷減少、環境污染的日益嚴重，給傳統的化石經濟帶來了巨大沖擊，各國均在探索新的社會和經濟的可持續發展模式。在此背景下，工業生物技術因其資源可再生、環境友好、過程簡單且高效專一等特點，一經提出便備受關注，被普遍認為是可以解決人類目前面臨的資源、能源及環境危機的有效手段。為此，美國、日本和歐洲的一些發達國家已制定了在今后幾十年中用生物過程逐步取代化學過程的戰略計劃。針對我國經濟高速發展、人均資源嚴重短缺、環境污染非常嚴重的具體國情，大力發展工業生物技術，更是實現我國社會可持續發展的重要途徑之一。

工業生物技術從提出至今不過十多年的時間，但發展卻非常迅速。就全球而言，現代生物技術已經滲透到包括醫藥、農業、能源、化工、環保等幾乎所有的工業領域，并扮演著極為重要的角色。生物技術在環境、材料、信息等領域的應用也在不斷擴大和加強。我國工業生物技術科技和產業發展迅速，部分產業的規模在世界上已占有舉足輕重的地位。然而技術水平低、市場競爭力弱仍是制約我國工業生物技術產業發展的瓶頸問題。在這樣的背景下，《生物工程學報》策劃并組織出版本期“工業生物技術”專刊，集中介紹國內該領域專家學者在基因工程、代謝工程與合成生物學、生理工程、發酵工程與生化工程、生物催化與生物轉化等方面的最新研究成果。

在基因工程研究領域中，開發新功能的酶/活性多肽、提高蛋白質的異源表達量、酶編碼基因的鑒定及酶活性的快速檢測等依然是研究熱點和重點。江南大學陳衛等[1]通過基因搜索工具篩選出一種新的 IIa類細菌素，并通過融合表達實現了該細菌素在大腸桿菌中的高效可溶表達。為了實現目標蛋白在畢赤酵母中的規模化制備，江南大學許正宏等[2]用雙質粒共表達體系將一種潛在的糖尿病治療藥物——人胰高血糖素樣肽-1-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的表達量提高了 50%。值得一提的是，研究者還開發了利用硝酸纖維素膜固定菌落分泌的蛋白，再利用將濾膜與抗體雜交顯色的免疫斑點法，可以同時篩選幾百個轉化子中目標蛋白的表達量，提高了篩選的效率和準確度，為其他類似研究提供了借鑒。河北大學張利平等[3]用重疊延伸PCR的方法獲得三孢布拉霉CarRA蛋白的編碼基因，并在大腸桿菌體內構建了該酶的活性檢測方法，可以通過顏色互補，方便快速地檢測出該酶的番茄紅素環化酶功能活性和八氫番茄紅素合成酶功能活性。

發酵工業是工業生物技術的核心產業。目前，已有超過500種產品 (覆蓋50個行業) 是通過大規模的微生物發酵生產的[4]。目前我國發酵工業正以每年20%的速度快速發展，預計到2015年，我國發酵工業產值將超過1萬億人民幣。針對不同發酵產品，許多研究者分別從代謝工程、合成生物學、生理工程、發酵工程、生化工程等角度，開展了創新的研究工作。

在代謝工程方面，宿主中目標產物代謝途徑中還原力NAD(H) 或NADP(H) 的不平衡問題，嚴重制約了目標產物的大量生產。為了解決此問題，中國科學院微生物研究所李寅和周杰等[5]阻斷了藍藻Synechocystis sp. PCC 6803中聚羥基丁酸酯PHB合酶編碼基因，在不影響細胞生長的情況下，減少了副產物PHB的合成，提高了細胞內NADPH的水平，構建了一個改變碳流向并具有充足還原力的工程藍藻，為藍藻產化學品奠定了基礎。南京工業大學姜岷等[6]則針對大腸桿菌利用葡萄糖生產丁二酸時NADH的供給問題，在宿主中過量表達依賴NAD+的蘋果酸脫氫酶，使重組菌恢復了厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。同時為了減少副產物形成，研究者還敲除了大腸桿菌中乳酸脫氫酶和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因，阻斷了丁二酸合成的代謝支路。最終采取兩階段發酵時，丁二酸濃度和得率分別達到15 g/L和1 g/g葡萄糖，生產強度為1 g/(L·h)。

除了改變代謝途徑中還原力不平衡的問題以外，提高代謝途徑中限速酶的表達量也是加強整個代謝途徑、提高目標產量的有力方法。在這一方面，江南大學饒志明和許正宏等[7]，在研究來源于鈍齒棒桿菌的 N-乙酰鳥氨酸轉氨酶的酶學性質的基礎上，在鈍齒棒桿菌中過表達該基因，將其精氨酸產量提高了15%。另外，在非天然宿主中構建目標產物代謝途徑以及加強天然宿主利用非天然底物的能力這兩個方面也取得了一定的進展。江南大學石貴陽和張梁等[8]從自然樣品中篩選分離得到一株能在pH 2.5 (乳酸調節) 的培養基中生長且不利用乳酸的酵母，通過在其中表達來源于米根霉 As3.819的乳酸脫氫酶編碼基因并初步優化其培養條件，可使乳酸產量達到40 g/L以上。大連理工大學袁文杰和白鳳武等[9]，從馬克斯克魯維酵母中擴增出菊粉酶編碼基因，并導入釀酒酵母工業菌株中，以200 g/L粗菊芋粉生料進行乙醇發酵時，重組菌株的發酵終點乙醇濃度可達55 g/L，糖醇轉化率為0.495，達到理論值的 96.9%，為非糧作物菊芋生產燃料乙醇奠定了良好基礎。

始于 21世紀初的合成生物學的核心是通過設計和構建自然界中不存在的人工生物系統，來解決能源、材料、健康和環保等問題。主要技術包括DNA的合成，來自多種微生物中基因及代謝途徑的組裝，多基因的精密調控等。為了構建抗瘧疾藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11-二烯的人工合成途徑，軍事醫學科學院方宏清等[10]在大腸桿菌中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大腸桿菌內源的法尼基焦磷酸，成功獲得了紫穗槐-4,11-二烯。另外，還通過引入糞腸球菌的甲羥戊酸途徑來增加前體供給，并過表達代謝途徑中3個限速酶，最終使搖瓶中紫穗槐-4,11-二烯產量達到235 mg/L，為高效合成紫穗槐-4,11-二烯奠定了基礎。

以上代謝工程和合成生物學均是以提高目標產物產量為主要目標。但是要想實現實際的工業應用，除了提高目標產物的合成能力外，菌株的工業適應性 (包括抵抗生產過程中pH、溫度、滲透壓等環境條件的波動，對產物或底物抑制不敏感，菌株在發酵過程中的穩定性等) 也同樣非常重要，生理工程的概念應運而生[11]。為了提高工業釀酒酵母在乙醇發酵中抗溫度脅迫的能力，中國科學院微生物研究所何秀萍和張博潤等[12]先用傳統的化學誘變劑(硫酸二乙酯) 處理酵母細胞，再提取優勢突變株的DNA，經上述誘變劑處理后重新導入親本細胞，最終獲得重組菌株的最高生長溫度比原始菌株提高了3 ℃，在30 ℃~40 ℃范圍內具有良好的糖醇轉化率和乙醇產量，發酵200 g/L葡萄糖能夠產生83.8~91.2 g/L乙醇。這一結合了化學誘變和基因組DNA誘變的方法，也可為改造其他宿主的其他生理功能提供借鑒思路。

除了前述基因工程、代謝工程、合成生物學、生理工程這些工業生物技術的上游研究以外，針對發酵產品的發酵工程以及針對酶的生化工程這類中、下游研究同樣重要。在發酵工程方面，江南大學吳敬等[13]優化了大腸桿菌表達嗜熱子囊菌角質酶的發酵條件，最終使3 L發酵罐中角質酶酶活達到 506 U/mL，是迄今國內外報道細菌來源角質酶的最高水平。集美大學蔡慧農等[14]優化了7 L罐中法夫酵母產蝦青素的pH值調控方式及補料培養基成分對發酵的影響，最終在 1 m3罐中試補料發酵時，蝦青素和總類胡蘿卜素的體積產率分別達到279.96 mg/L和618.01 mg/L。而在生化工程方面，四川大學廖學品等[15]用三價鐵改性膠原纖維，在固定過氧化氫酶時表現出了優良的固定化載體性能。

生物催化與生物轉化是用具有催化能力的全細胞或酶將原料轉化為目標產品，被 經濟合作與發展組織 (OECD) 定位為構建和環境協調的產業體系的關鍵技術。在這一方面，江南大學石貴陽等[16]在枯草芽胞桿菌中表達羰基還原酶，實現了用全細胞催化底物 1-苯基-2-甲氨基丙酮生成 d-偽麻黃堿。由于該酶促反應需要NADH，所以研究者把該反應置于枯草芽胞桿菌中進行，并利用細胞內源的葡萄糖脫氫酶完成輔酶再生。最終在葡萄糖存在的情況下，該重組枯草芽胞桿菌生成d-偽麻黃堿的產量為97.5 mg/L，底物摩爾轉化率為24.1%。為了研究溫度在β-1,3-葡聚糖酶分解酵母β-葡聚糖時的作用，山東大學盧雪梅等[17]采用分體模塊設計，研制了一種新型的溫度梯度產生裝置，可以快速、精準、連續地實現多個溫度的控制。研究結果不但能為寡糖生產提供精確的溫度控制參數，也為其他需要精確連續控溫的實驗提供了方便。通過分子定向進化，改善和提高酶的性能，一直是這一領域的研究熱點。暨南大學姚冬生等[18]采用易錯PCR的方法，獲得了耐高溫和在酸、堿條件下均穩定的黃曲霉毒素解毒酶突變體，為提高體外直接降解黃曲霉毒素的效率奠定了基礎。

最后，在生物技術與方法方面，衛生部抗生素生物工程重點實驗室武臨專等[19]開發了一種快速檢測抗生素洋橄欖葉素的化學方法，主要包括TLC硅膠板分離、NaOH溶液顯色、HPLC和LC-MS分析。同時，還可以利用該抗生素生物合成基因簇中的tgd基因的PCR檢測與序列分析，對該抗生素的生產菌進行快速檢測。

希望本期專刊能為國內從事相關領域的研究者提供借鑒和參考，促進我國工業生物技術進一步發展。

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