連續溫度變化對β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影響

段峰，盧雪梅，段永成，高培基

山東大學 微生物國家重點實驗室，濟南 250100

溫度是生命環境的重要因素之一，是生命科學研究工作中必須控制的首要條件。研究溫度對生命體生長繁殖的影響，以及溫度對生物酶反應的效率等是生命科學研究領域中的一個關鍵內容。目前實驗室所用恒溫裝置主要是空氣浴、水浴形式，對溫度的控制為一室一控。在一個恒溫裝置中進行一次實驗只能獲得一個溫度點的特性數據，欲完成一條溫度特性曲線的完善描述，還需要多次實驗才能完成，由于多次實驗要受到環境條件、儀器穩定性、試劑配制、操作手法等不確定性因素干擾，所得各溫度點的數據不適合溫度特性研究工作。綜觀已報道的溫度對微生物生長和產物形成過程分析的報告，都是依據上述溫度梯度試驗結果而作出的，通常都是相隔5 ℃和溫差±1 ℃下得到的，由此可見一個確切的溫度影響的動力學過程是難以得到的，特別是對于“轉折點”的判斷會造成顯著誤差，而這又是微生物生理學和生物工程學上的重要參數。早在1958年，Halldal和French開始利用金屬鋁板產生溫度梯度，在其上鋪瓊脂介質支持海藻生長，并利用水槽、毛玻璃、紙梳形成光照梯度，進行溫度與光照兩個因素對海藻生長影響的研究[1]。后來有許多研究者改進或自行設計新型溫度梯度裝置進行溫度特性的相關研究工作。Thompson利用自制“溫度梯度柵”研究了溫度對野生植物種子的發芽影響與其對自身生長環境適應性的關系[2]；Blankley等利用燈泡為熱源，冷端暴露等設計了一種簡易的溫度梯度產生裝置，研究了溫度對卡氏球鈣板藻Cricosphaera carterae 生長的影響[3]；Youdeowei采用金屬銅片作為溫度梯度產生介質，研究了紅蝽Dysdercus intermedius的溫度適應行為[4]；Clark等設計了一種不連續溫度梯度小室裝置，研究了細胞生長與病毒復制的溫度特性[5]；Battley在前人設計基礎上，改進并研究了連續溫度梯度下微生物生長的最大、最適、最低生長溫度，解決了非連續梯度實驗中個別的適應性生長現象給判定生長溫度極限帶來的誤差[6]；Siver改進了培養海藻的裝置，使其可產生較大范圍的溫度梯度[7]。近些年，出現了一些較為特別的改進。Wolf等設計了微型化、穩定線性化的溫度梯度裝置[8]；Mao等設計了一種可控微流多通道的線性溫度梯度裝置，可廣泛用于研究催化反應活化能、熔點、熒光量子產生曲線等[9]；Grodzicki等在傳統溫度梯度裝置上加裝紅外線探測器，并接入計算機實時記錄，研究了蜜蜂和蟑螂適應溫度個體和群體表現行為的差異[10]。另外還有許多采用相似溫度梯度裝置進行研究的報道[11-15]。

作者依據金屬板能產生連續溫度梯度的特性與生物溫度特性研究工作的需要，設計了具有連續溫度梯度板面和等間隔溫度梯度孔等的實驗裝置，可在溫度梯度孔中放置 2×20個實驗管，可一次獲取20個梯度溫度點的特性數據，足以精確描繪溫度特性曲線，可廣泛應用于微生物液固培養、生物酶反應、植物種子發芽、昆蟲繁育等相關生物技術領域的溫度特性研究。

β-1,3-葡寡糖是重要的功能性糖，可作為植物抗真菌病害免疫促進劑，也有抗糖尿病活性[16]，還可誘導人血細胞產生抗腫瘤因子[17]等。本室研究獲得一株殼聚糖酶產生菌Mitsuaria chitosanitabida H12 (CGMCC 2949)，研究發現其產生一種內切型β-1,3-葡聚糖酶，可用來制備β-1,3-葡寡糖，并發現溫度是影響水解產物組分的重要因素，對其不同溫度下的酶解進一步研究有望獲得大分子產物，擴大該酶的應用領域。本文利用生化溫度特性實驗儀詳細研究了溫度對該酶酶解酵母 β-葡聚糖過程的影響，求出了反應活化能、溫度衰減方程、產物組分變化等。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與β-1,3-葡聚糖酶

Mitsuaria chitosanitabida H12，由山東大學微生物國家重點實驗室提供；經由液體發酵、離心獲得上清、硫酸銨鹽析獲得粗酶，該粗酶經分離純化為單一內切型β-1,3-葡聚糖酶，其最適反應溫度和pH分別為52 ℃和5.2。

1.2 主要儀器與試劑

溫度梯度產生裝置為自制生化溫度特性實驗儀(專利號：201020015088.1)，示意圖見圖1。該儀器通過在金屬鋁板兩端分別加熱和制冷形成線性溫度梯度，并具有 20個等溫差梯度孔和連續的溫度梯度板面，溫度波動范圍小于±0.1 ℃，設計高端極限95 ℃，低端極限?2 ℃，最大溫差60 ℃。利用等溫差梯度孔進行固體試驗時采用普通試管；液體試驗時采用“L”型試管，封閉端插入試驗孔中，開口端向上，溫度梯度板以圖1“C”為中軸作弧形往復轉動，則試驗液體在管中作往復流動。利用連續溫度梯度板面進行試驗時可采用普通平皿。

β-葡聚糖購于安琪酵母有限公司，β-葡聚糖含量70%；昆布二糖、昆布五糖購于 Seikagaku Kogyo (Japan)；昆布三糖、昆布四糖購于 Sigma-Aldrich (USA)；其他試劑為分析純，水為去離子水。

1.3 β-葡聚糖的酶解方法

將 β-葡聚糖和0.2 mol/L乙酸緩沖液 (pH 5.2)以3.5 ∶ 100 (W/V) 的比例混勻后，121 ℃滅菌30 min，趁熱磁力攪拌并自然冷卻。每支“L”型試管分裝9.00 mL，插入試驗孔 (圖1B所示) 中并轉動梯度板進行預熱15 min，分別加入1.00 mL酶液，在設定時間點取樣，每次取樣200 μL，加入含800 μL無水乙醇的1.5 mL離心管中，混勻終止反應，10 000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.4 酶解產物的分析

1.4.1 酶解產物的還原糖分析

采用DNS法測定[18]：取400 μL適當稀釋后的樣品加入DNS試劑400 μL，沸水浴10 min，立即冷卻，取200 μL加入96孔板，并于酶標儀 (Victor3TMV，PE company，USA) 上550 nm讀數，以葡萄糖為標準還原糖當量計算還原糖濃度。

圖1 生化溫度特性實驗儀主要組成部件示意圖Fig. 1 Diagram of Biochem-temperature Characteristic Apparatus. One end of aluminum board contains cartridge heaters (E), and the other end is connected to the circulating cooling device. Temperature is monitored by adjacent thermistor. The pump (D), tank, refrigerator, temperature controller, motor, and all the other components of the apparatus are placed in chassis except the aluminum board which was supported by bracket.

1.4.2 酶解產物的組分分析

酶解產物寡糖組成由薄層色譜 (TLC) 進行分析，薄層板采用TLC-60 plate (Merck TLC Silica gel 60 F254)，點樣采用半自動電動點樣儀 (上?？普苌萍加邢薰?，展層劑為乙酸乙酯∶乙酸∶水= 2∶2∶1 (V∶V∶V) ，顯色條件為10% (V/V) 硫酸-乙醇溶液噴霧后130 ℃加熱10 min[19]。

1.4.3 酶解產物的純化

酶解液經離心獲得上清，減壓蒸發至折光10%~15%，加入1%活性炭于70 ℃保溫30 min脫色，脫色液進行活性炭柱層析分離[20]，洗脫液為水∶乙醇 (V/V)=1∶3，洗脫液經減壓蒸發除掉乙醇，冷凍干燥后為純化的酶解產物樣品。

2 結果與分析

2.1 溫度對 β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母 β-葡聚糖的影響

對于生物酶酶解反應來說，一般是溫度升高則反應速度提高，在長時間酶解反應過程中，過高的溫度可提高初始速度但加速酶的失活，不利于產物的積累，而較低的溫度有利于酶的穩定。利用生化溫度特性實驗儀，在22 ℃~60 ℃范圍內以2 ℃為間距的20個等溫差實驗點，進行了酶解實驗，研究了溫度對該酶酶解酵母 β-葡聚糖反應過程的影響。圖2為采用Interpolant函數 (MATLAB R2009b sftool)以溫度和時間對產物濃度作圖。從圖 2上的不對稱可以得出，隨水解時間的延長，產物積累最大的溫度并不是一成不變的，而是略微下降的。即酶解反應開始1 h內，最大產物積累接近50 ℃，而9 h則下降到40 ℃附近。

通過對每個采樣時間點的數據進行Gaussian函數平滑(MATLAB R2009b cftool)，并獲得最大值對應的溫度，以時間對其作圖 (圖 3)，在采樣時間區域內的最適溫度隨時間的變化呈指數衰減。其中由擬合方程參數c給出的極限最適溫度39.54 ℃與該酶的熱穩定性相吻合 (40 ℃以下保溫24 h，殘存活力大于90%，數據未列出)；由方程指出的0時刻的最適溫度49.32 ℃與該酶的最適反應溫度52 ℃相接近，說明該指數方程能很好的解釋最適酶解溫度隨時間的變化過程。

圖2 溫度與反應時間對酶解產物生成的影響Fig. 2 Effects of temperature and reaction time on the hydrolytic products. Yeast β-glucan was hydrolyzed by β-1,3-glucanase (1 U/mL) under different temperature (22 °C?60 °C, 2 °C intervals) on the Biochem-temperature Characteristics Apparatus.

圖3 最適酶解溫度與時間的關系Fig. 3 Relationship between the optimum temperature and the reaction time. The optimum temperature at each time point was solved by Gaussian curve fitting in MATLAB R2009b to the data from Fig.2.

該酶對酵母 β-葡聚糖的水解歷程符合雙曲線方程，如圖4的46 ℃、48 ℃所示；而58 ℃、60 ℃等高溫區，因酶快速失活，用雙曲線擬合極限比較準確，但相應初速度的擬合值偏差會較大；24 ℃、26 ℃等低溫區，酶解歷程基本呈直線變化，同用雙曲線擬合，與高溫區相反，初速度較為準確，極限值并不合理。說明酶解過程在高溫區產物積累速度迅速減低，主要是伴隨著酶的熱失活；而低溫區，酶解速度微量下降主要是由于底物濃度的下降引起的。

圖4 酵母β-葡聚糖的酶解反應歷程Fig. 4 Hydrolytic process of yeast β-glucan by β-1,3-glucanase at different temperature. The data for hyperbolic curve-fitting came from Fig. 2.

根據酶解反應歷程曲線，求得每個溫度下的酶解反應初速度 (原點處的一階導數) 代替反應速率常數，并以?1/RT對其做圖 (圖5)，可以得到酶解最大初始反應速度在 48 ℃~50 ℃(?1/RT=[?3.745，?3.722]×10?4)之間，從全部數據范圍看，該反應類型不符合阿累尼烏斯經驗公式，然而48 ℃之前的反應可以用阿累尼烏斯經驗公式來解釋，其活化能Ea為84.17 kJ/mol。

2.2 溫度對酶解產物組分的影響

2.2.1 對酶解產物組分的TLC分析

圖5 酶解反應初始速度與溫度的關系Fig. 5 Initial reaction rate changed with temperature. The xlabel, ‘R’ is molar gas constant and ‘T’ is absolute temperature.‘V0’ is initial velocity, ‘A’ is pre-exponential factor, ‘Ea’ is activation energy. The initial velocity at 22 °C?48 °C was solved by hyperbolic fitting and seeking the first-order derivative at its origin (0) point.

圖6 不同溫度酶解產物組分的TLC分析Fig. 6 Thin-layer chromatography of hydrolytic products of yeast β-glucan by β-1,3-glucanase at different temperature. G is glucose; L2?L5 are laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose and laminaripentaose, respectively. ‘S’ is 1,3-β-D-glucooligosaccharide markers comprising G and L2?L5.

溫度對該酶酶解酵母 β-葡聚糖的影響，不僅表現在酶解產物生成速度上 (圖 4)，而且表現在水解產物組分上。上文2.1節的8 h產物經薄層色譜分析(圖6)，結果顯示，酶解產物組分隨溫度變化可以劃分為4個部分：1) 50 ℃以上，產物主要以昆布二糖和昆布三糖為主；2) 46 ℃~42 ℃，大于昆布三糖的寡糖比例已經有明顯增加；3) 38 ℃~30 ℃，以昆布二糖-五糖為主；4) 30 ℃以下，產物以昆布五糖及更大分子量的寡糖為主。

2.2.2 酶解產物組分的13C NMR鑒定

酶解產物樣品，同標準品昆布二糖和昆布三糖用D2O配制成20 mg/mL進行13C NMR (AVANCE 400) 測定，結果見圖7。根據SDBS數據庫 (Spectral Database for Organic Compounds，Japan) 中的昆布二糖 (SDBS No.11561)13C NMR圖譜說明，其β-1,3-D-glycosidic的C3特征化學位移在83和85附近，樣品與標準品對照完全一致，為 1,3-β-D-葡寡糖。

3 討論

3.1 生化溫度特性實驗儀

諸如前言中所述，溫度梯度裝置的發展中有許多研究工作者對其做了相應改進，以求達到實驗目的和要求。這些改進主要分為 2個方面：一是溫度梯度裝置本身，例如，在梯度板上做圓孔配合試管達到不連續溫度梯度液體培養的需求[21-23]；在梯度板上做與梯度平行的凹槽配合試管達到連續溫度梯度固態培養需求[6]；在梯度板上用絕熱材料將板面分成若干小室，配合細胞培養瓶培養細胞和病毒[5]。雖然梯度板的溫度梯度是線性的[3]，其內部孔也是線性的[21]，但是裝置兩端的溫度不是完全線性[5]，這是由于分開的小室在溫度梯度板外，小室內的溫度受環境影響較大。二是附屬裝置，例如，增加光照部分配合海藻等生長的需求[1,3,7]；增加紅外探測部分配合昆蟲的檢測[10]。但它們都是為滿足單一實驗需求而改進的裝置，不適合多用途使用，而附屬裝置是獨立于溫度梯度裝置外的部分，與儀器本身性能影響無關。

圖7 純化的酶解產物的13C核磁共振波譜Fig. 7 13C NMR of 1,3-β-D-glucooligosaccharide and the purified products.

圖8 溫度對大腸桿菌生長的影響Fig. 8 Effects of temperature on the growth of E. coli. (A) Surface fitting of sample data using interpolant function of MATLAB R2009b. (B) Fitting of logistic equation to the data.

作者綜合前人的經驗，進一步完善和創新，設計并研制成功了一種用途更廣泛的新型溫度梯度產生裝置，命名為生化溫度特性實驗儀。該儀器采用分體模塊設計，使一套溫度梯度系統可以實現多功能。如圖1所示為進行液、固培養的梯度板，可以用來研究微生物生長曲線 (圖 8)、酶反應歷程(圖 2)、食用菌菌絲生發與出菇、植物根的生發等；使用工字型梯度板作為母板，分別使用不同配件可以實現固體培養管研究生長溫度極限[6,23]， Halldal等的平板培養[1]，Pires等的昆蟲研究[12]，還可以實現酶反應的溫度、pH與時間多因素影響等研究。除了上文中所述酶解酵母 β-葡聚糖條件的研究工作，作者還利用該儀器進行了大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、食用真菌等微生物生長的研究，圖8所示為大腸桿菌在該儀器上的生長情況，A為interpolant函數 (MATLAB R2009b sftool) 以溫度和時間對OD600作圖，B為部分數據的Logistic方程擬合，其R2＞0.98，可以看出溫度特性曲線平滑，具有很強的相關性，比傳統手段具有較強優勢，這主要是該儀器克服了傳統實驗中分次進行所造成的菌種不一致性等影響，因為即使以OD600控制每次實驗的接種量也不能保證菌種的生理狀態完全一致[24]；同時，該儀器的弧形往復振蕩方式優于旋轉與直線往復搖瓶機的性能，利于液體均勻混合與增加溶氧。

與溫度有關的多因素實驗中，該儀器在微生物生長溫度特性曲線研究中的優勢上文已論述，而如酶反應等實驗材料的穩定性影響可以忽略，因此傳統的分批次實驗對結果影響不大，但存在時間浪費較多的情況。例如作者在研究該酶的最適反應條件時，設計了3個因素 (溫度、pH與時間) 和4水平，其中反應時間最長為1 h，則需7 h完成實驗，而用該儀器只需2 h即可完成；而且該儀器的溫度波動范圍為±0.1 ℃，達到超級恒溫水浴的精度指標，且波動為同一時間同一方向，操作方便，便于精細研究。

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