阻斷集胞藻6803 PHB合成途徑提高胞內NADPH含量

解鵑，周杰，張海峰，李寅

中國科學院微生物研究所，北京 100101

藍 藻 (Blue-green algae) 又 稱 藍 細 菌(Cyanobacteria)，是一類能進行放氧光合作用的光合自養(yǎng)原核生物，能夠利用二氧化碳和太陽能快速繁殖。此外，藍藻具有細胞結構簡單、遺傳背景清楚、易于基因操作等特點。因此，隨著全球能源匱乏及氣候變暖的加劇，藍藻成為生產可再生化學品的潛在理想宿主。通過基因工程改造，已實現在藍藻中生產異丁醛、乙醇和氫等化學品[1-5]。但由于產量低，限制了藍藻化學品在工業(yè)領域的廣泛應用。

集胞藻6803是一種單細胞藍藻，已于1996年首次完成了基因組序列的測定，遺傳背景清楚，易于操作。所以本研究對集胞藻6803進行代謝途徑改造。

還原力NADPH是參與生物能量及碳代謝的重要輔助因子，具體包括參與微生物細胞內還原型生物合成、抗氧化、氧化脅迫等多個氧化還原反應[6-7]。目前，改變還原力流向已成為提高工業(yè)微生物化學品產量的有效方法[8]。近年來的研究進展表明，通過代謝工程改造提高胞內NADPH含量可提高需NADPH依賴型關鍵酶催化合成的化合物產量，如 L型氨基酸、脂類、多酚等[9-11]。因此，通過代謝工程改造提高細胞內NADPH含量將有利于集胞藻生產化學品。

聚羥基脂肪酸 (Polyhydroxyalkanoate，簡稱PHA) 是一類廣泛存在于微生物中的高分子聚脂，其中聚-β-羥基丁酸酯 (Poly-β-Hydroxybutyrate，簡稱 PHB) 是最常見的一種。在正常生長條件下，有些藍藻細胞可以積累少量PHB作為碳源和能量儲藏物質[12]。在限氮條件下，流向PHB合成途徑的碳源增加，PHB含量可達藍藻細胞干重的38%[13-14]。根據已報道的研究結果[12,19]，PHB作為細胞內的碳源和能源儲備物質，有利于細菌適應外界環(huán)境，增強生存能力。目前尚未有關于 PHB合成途徑敲除對細胞影響的報道。由圖 1集胞藻 PHB合成途徑示意圖[13]可知，PHB是由乙酰輔酶 A在相應的酶催化下聚合而成，該過程消耗NADPH，而PHB合酶作為該合成途徑中的最后一個酶而成為PHB合成的關鍵酶之一。正常生長狀態(tài)下細胞中雖有一定的PHB合成，但當細胞處于正常生長環(huán)境時，PHB不發(fā)揮作用，故推測集胞藻中此途徑的敲除對細胞影響不大。

圖1 集胞藻PHB合成途徑示意圖[13]Fig. 1 PHB synthesis pathway in Synechocystis[13].

對于用于生產化學品的集胞藻而言，PHB的合成消耗了目標化學品合成所需的還原力 NADPH及碳源，不利于進行目標化學品的生產。因此，阻斷集胞藻中PHB合成途徑，一方面可減少碳源在PHB合成上的消耗；另一方面，可使PHB合成中所需消耗的NADPH得以積累，提高了胞內NADPH的含量，從而利于工程集胞藻合成目標化學品。

本研究通過同源重組方法，用氯霉素抗性基因取代集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803) 基因組中PHB合酶編碼基因phaC和phaE，獲得PHB合成途徑被成功阻斷并伴有細胞內 NADPH含量提高的集胞藻突變體S.ΔphaC&E，為進一步開發(fā)集胞藻生產化學品，提高目標產品的產量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

大腸桿菌Escherichia coli DH5α、質粒pUC18、質粒pRL271、集胞藻6803均為本實驗室保存。

1.2 試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自寶生物工程(大連) 有限公司；DNA限制性內切酶、去磷酸化酶CIP、T4 DNA連接酶均購自NEB (北京) 有限公司；質粒 DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Omega公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌RNA提取試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；抗生素購自Amresco公司；其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；引物合成和測序由上海英駿生物工程有限公司完成。

1.3 基因敲除載體pUC-HR的構建

載體pUC-HR示意圖見圖2。通過PCR分別從集胞藻6803基因組中克隆到PHB合酶基因phaC和phaE上、下游各600 bp片段，分別命名為up、down。用融合 PCR方法將 down片段與來自質粒pRL271的氯霉素抗性基因 catP相融合[15]，獲得融合片段 down-Cm，并將其插入到質粒 pUC18的XbaⅠ位點，得到中間載體pUC-Cmdown。將up片段插入到中間載體pUC-Cmdown的SacⅠ和BamHⅠ位點，構建帶有up-Cm-down結構的用于PHB合酶基因敲除載體 pUC-HR。所用引物序列如需要可向作者索要。

圖2 基因敲除載體pUC-HRFig. 2 Diagram of gene knockout vector pUC-HR.

1.4 藍藻的轉化、篩選及鑒定

集胞藻6803置于光照培養(yǎng)箱 (GXZ-280c，寧波江南儀器廠) 中振蕩培養(yǎng)，溫度為30 ℃，光強為100 μm/(m2·s)，振蕩頻率為 130 r/min，培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基[15]。利用自然轉化方法并參照文獻中[17]關于提高轉化效率的優(yōu)化條件，用構建好的載體pUC-HR轉化集胞藻6803，用10 mg/L氯霉素篩選轉化子。分別提取野生藻、轉化子的基因組DNA作為模板，用up片段5′引物和down片段的3′端引物進行PCR擴增，鑒定基因組完全分離的突變體S.ΔphaC&E。1%瓊脂糖電泳后使用凝膠成像儀(EC3，UVP) 檢測擴增產物。

1.5 RNA提取及RT-PCR

用RNA提取試劑盒 (天根生化科技有限公司，北京) 提取野生藻 S.wt和突變體 S.ΔphaC&E的總RNA。用不含 RNA酶的 DNA酶處理提取的總RNA，以去除殘留的DNA。用Quant反轉錄酶進行反轉錄，為檢測可能殘留的DNA污染，用Taq聚合酶代替反轉錄酶為對照。按擴增基因靠近 3′末端400~500 bp的原則設計引物，對反轉錄產物進行PCR擴增[4]。之后用1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.6 藍藻生長的測定

按比例分別接種野生藻 S.wt和基因敲除藻S.ΔphaC&E，確保兩種藻細胞的起始OD730一致，均為 0.2。吸光度測量使用 UNICO型號為 7200 spectrophotometer的紫外-可見分光光度計。光照振蕩培養(yǎng)，每隔24小時取藻液測定OD730，并以此做出生長曲線，比較野生藻 S.wt、基因敲除藻S.ΔphaC&E之間生長差異。

1.7 胞內PHB含量測定

參照文獻用氣相色譜測定胞內PHB含量[14,16]。所用氣相色為島津公司的 GC2010氣相色譜儀，色譜柱為DB-5毛細管柱，柱長30 m，內徑320 μm。柱溫170 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣N20.14 MPa，使用氫焰檢測。

取80 mg左右干細胞于酯化管中，加入2 mL酯化液 (含有2 g/L苯甲酸、3% (V/V) 濃硫酸的甲醇溶液) 和2 mL氯仿，加蓋密閉，100 ℃酯化反應4 h。冷卻至室溫后，加入1 mL去離子水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相進行氣相色譜分析。使用內標法定量分析胞內的PHB含量。

1.8 胞內NADPH含量測定

根據文獻方法[17-18]，使用酶標儀 (SpectrsMax 190，Molecular Devices) 測定藍藻細胞內的NADPH含量。分別取處于對數生長期的野生藻及突變體30 mL (OD730≈0.8)，離心收集細胞。加入 1 mL 0.3 mol/L高氯酸，1 mmol/L EDTA，充分振蕩30 s，裂解細胞。離心棄細胞碎片，取上清。取0.5 mL上清，加入0.1 mL 2 mol/L K2CO3中和反應。取上清，檢測細胞液在340 nm的吸光度。根據NADPH濃度與OD340關系的標準曲線，確定胞內NADPH的濃度。

2 結果

2.1 藍藻基因敲除載體pUC-HR的構建

經DNA測序分析可知，從集胞藻6803基因組中克隆的PHB合成酶基因phaC上游600 bp片段up和 phaE下游 600 bp片段 down，及從質粒pRL271[15]克隆的氯霉素抗性基因catP (1 050 bp)，序列均正確。

如載體酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜所示 (圖3)，用XbaⅠ進行酶切，載體被切成3.3 kb和1.6 kb片段；用BamHⅠ和SacⅠ進行酶切，分別切出約4.3 kb和0.6 kb片段，兩組酶切結果均與預期得到的片段大小相符。同時對基因敲除載體pUC-HR中的 up-Cm-down片段進行 DNA測序分析，證明pUC-HR中的up-Cm-down的方向及序列正確。因此表明集胞藻 6803基因 phaC和 phaE敲除載體pUC-HR構建成功。

圖3 敲除載體pUC-HR酶切產物的凝膠電泳圖譜Fig. 3 Identification of plasmid pUC-HR by restriction enzyme digestion. 1: pUC-HR digested with Xba I; 2: pUC-HR digested with Sac I and BamH I; M: DNA marker III.

2.2 敲除 phaC和 phaE的集胞藻 6803突變體S.ΔphaC&E的獲得

為敲除集胞藻6803基因組中的PHB合酶編碼基因 phaC和 phaE，用構建的基因敲除載體pUC-HR轉化集胞藻6803。經過反復抗生素篩選，用基因 phaC上游片段 up5′端和 phaE下游 down3′端引物分別對轉化子和野生型藍藻基因組 DNA進行PCR擴增，如圖4所示，以野生藻為模板則擴增得到3.4 kb片段，而以轉化子基因組DNA為模板擴增得到大小在2.26 kb片段，與預期的大小相符，證明集胞藻6803基因組中phaC和phaE基因 (約2.2 kb) 完全被氯霉素抗性基因catP (約1 kb) 取代，已成功得到基因組完全分離的基因敲除突變體S.ΔphaC&E。

圖4 集胞藻完全分離基因敲除突變體 S.ΔphaC&E的PCR驗證Fig. 4 Identification of complete segregation Synechocystis mutant S.ΔphaC&E by PCR. 1: S.wt; 2: S.ΔphaC; M: DNA marker III.

為進一步從轉錄水平證明phaC和phaE失活，對突變體及野生型進行了RT-PCR比較分析。如圖5所示，以野生藻S.wt cDNA為模板檢測不到氯霉素抗性基因片段，但以基因敲除藻 S.ΔphaC&E的cDNA為模板，可檢測到氯霉素抗性基因片段。同時，以野生藻S.wt的cDNA為模板可檢測到PHB合酶基因片段，但以基因敲除藻S.ΔphaC的cDNA為模板，則檢測不到PHB合酶片段。因此，RT-PCR結果進一步證明，藍藻突變體 S.ΔphaC&E中 PHB合酶編碼基因已經被氯霉素抗性基因取代。

圖5 RT-PCR鑒定基因敲除集胞藻突變體S.ΔphaC&EFig. 5 Identification of the transcription of chloromycetin resistance gene and PHB synthase gene in Synechocystis mutant S.ΔphaC&E by RT-PCR. 1: transcription of catP in S.wt; 2: transcription of chloromycetin resistance gene in S.ΔphaC&E; M: DNA marker I; 3: transcription of PHB synthase gene in S.ΔphaC&E; 4: transcription of PHB synthase gene in S.wt.

2.3 藍藻生長的測定

成功構建藍藻突變體S.ΔphaC&E后，對野生型及突變體的生長進行了比較研究。從生長曲線 (圖6) 可以看出，PHB 合酶基因敲除藍藻突變體S.ΔphaC&E的生長雖然略低于野生藻S.wt，但差異不大。這說明PHB合酶編碼基因的敲除基本不影響藍藻的生長。

2.4 集胞藻胞內PHB含量檢測

圖6 野生集胞藻S.wt和集胞藻突變體S.ΔphaC&E的生長曲線Fig. 6 Growth curves of S.wt and Synechocystis mutant S.ΔphaC&E.

為檢測敲除phaC和phaE能否阻斷藍藻PHB的合成，對野生藻和突變體的胞內PHB含量進行了測定。結果發(fā)現，野生藻S.wt中PHB積累約為細胞干重的 2.3% (2.30±0.12)，而基因敲除突變體S.ΔphaC&E中沒有 PHB的積累 (0.00±0.05)，說明phaC和phaE的敲除能夠阻斷藍藻中PHB的合成。

2.5 胞內NADPH含量檢測

由于PHB的合成是消耗NADPH，因此對突變體和野生型胞內 NADPH含量進行了比較分析。根據文獻[17-18]中的NADPH檢測方法，對野生藻S.wt和突變體S.ΔphaC&E中的NADPH進行測定，得到NADPH濃度與OD340對應關系的標準曲線，公式為：y=10.333x?0.111，R2=0.998。其中，x為 OD340；y為 NADPH濃度 (nmol/L)。根據標準曲線，得到NADPH含量隨培養(yǎng)時間變化曲線，如圖7所示，突變體S.ΔphaC&E胞內的NADPH含量明顯提高，為野生藻 S.wt NADPH含量的 2.85倍。說明集胞藻6803細胞中 PHB合成途徑的阻斷，可以使胞內NADPH含量提高。

圖7 野生集胞藻S.wt和集胞藻突變體S.ΔphaC&E胞內NADPH的檢測結果Fig. 7 Detection of celluar NADPH contents of S.wt and Synechocystis mutant S.ΔphaC&E.

3 討論

利用代謝工程技術敲除生物代謝途徑中的關鍵基因，并結合輔因子工程技術，改變代謝流分布，構建新的代謝途徑，在微生物代謝工程中具有重要作用[6]。

本研究結合代謝工程和輔因子工程的方法，以藍藻PHB合成途徑為改造對象，通過敲除PHB合酶基因成功阻斷集胞藻6803中PHB的合成，獲得胞內還原力 NADPH含量明顯提高的工程藍藻S.ΔphaC&E。由于集胞藻6803的基因組是多拷貝的，因此我們通過對轉化子的反復多輪篩選，得到基因組完全分離的藍藻基因敲除突變體S.ΔphaC&E。在正常培養(yǎng)條件下集胞藻6803細胞內是有PHB積累的。Hein’s等通過在大腸桿菌中表達集胞藻 6803 PHB合酶基因phaC和phaE，使大腸桿菌中可以產生PHB來證明PHB合酶是藍藻PHB合成的關鍵酶[19]。而本工作通過在藍藻中敲除PHB合酶基因阻斷PHB合成，更直接證明PHB合酶是集胞藻6803 PHB成途徑的關鍵酶。在本研究正常培養(yǎng)條件下，野生藻S.wt可以積累細胞干重2.3%的PHB作為碳源和能量儲備，這與前人的實驗結果相一致[12]。同時發(fā)現阻斷PHB合成對藍藻的生長影響很小。推測原因應與 PHB的生理功能有關。根據已報道的研究結果[19]，PHB作為細胞內的碳源和能源儲備物質，有利于細菌適應外界環(huán)境，增強生存能力。正常生長狀態(tài)下雖有一定的PHB合成，但當細胞處于正常生長環(huán)境時PHB不發(fā)揮作用，同時PHB的合成途徑與藍藻生長的途徑無關聯，所以它的敲除對正常環(huán)境下生長的細胞影響不大。因此，敲除PHB合成酶編碼基因阻斷PHB合成，可以實現藍藻中碳流的重新分配，即把原本用于合成PHB的碳源用于目標化學品的合成，使細胞內有限的碳源得到更有效地利用，從而提高藍藻目標化學品的產量。

PHB合成途徑需要有還原力NADPH的參與[13]，而本研究通過阻斷PHB合成得到胞內NADPH含量增加的工程藍藻也進一步證明了這一點。還原力NADPH/NADH是參與微生物代謝的重要輔助因子，而微生物細胞內具有實現NADPH與NADH相互轉化的能力。近期McNeely等[20]的研究結果表明，增加藍藻胞內還原力水平，可以提高藍藻相應代謝產物水平，如乙酸，琥珀酸等。因此，本研究實現胞內NADPH含量提高，這將為藍藻合成還原型化合物提供充足的還原力，為進一步提高藍藻化學品產量，開發(fā)藍藻產醇類、脂類等化學品奠定基礎。

綜上所述，本研究通過敲除PHB合成酶編碼基因phaC和 phaE成功阻斷了集胞藻6803中的PHB合成，實現胞內還原力 NADPH的有效積累，并且與野生藻相比，突變體藍藻S.ΔphaC&E的生長沒有受到影響。本實驗一方面由于成功阻斷PHB的合成，可以實現藍藻中碳流的重新分配，為提高目標化學品產量作了碳源重新分配上的準備；另一方面提高了藍藻胞內 NADPH水平，為實現藍藻產化學品、提高目標產物產量提供了充足的還原力。因此，本研究所建立的成功阻斷 PHB合成途徑同時實現NADPH提高的藍藻突變體 S.ΔphaC&E，為藍藻產目標化學品作了碳源和還原力方面的準備，為藍藻產醇類、脂類等還原型化學品、提高化學品產量提供了理想菌株。

REFERENCES

[1] Atsumi S, Higashide W, Liao JC. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat Biotechnol, 2009, 27(12): 1177?1180.

[2] Cadoret JP, Bernard O. Lipid biofuel production with microalgae: potential and challenges. J Soc Biol, 2008, 202(3): 201?211.

[3] Ghirardi ML, Dubini A, Yu JP, et al. Photobiological hydrogen-producing systems. Chem Soc Rev, 2009, 38(1): 52?61.

[4] Deng MD, Coleman JR. Ethanol synthesis by genetic engineering in cyanobacteria. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 523?528.

[5] Zhou J, Li Y. Engineering cyanobacteria for fuels and chemicals production. Protein Cell, 2010, 1(3): 207?210.

[6] Xia WL, Wang Z, Wang Q, et al. Roles of NAD+/ NADH and NADP+/ NADPH in cell death. Curr Pharm Des, 2009, 15(1): 12?19.

[7] Ying WH. NAD+/NADH and NADP+/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(2): 179?206.

[8] Qin Y, Dong ZY, Liu LM, et al. Manipulation of NADH metabolism in industrial strains. Chin J Biotech, 2009, 25(2):161?169.秦義, 董志姚, 劉立明, 等. 工業(yè)微生物中 NADH的代謝調控. 生物工程學報, 2009, 25(2): 161?169.

[9] Chemler JA, Fowler ZL, McHugh KP, et al. Improving NADPH availability for natural product biosynthesis in Escherichia coli by metabolic engineering. Metab Eng, 2010, 12(2): 96?104.

[10] Bartek T, Blombach B, Zonnchen E, et al. Importance of NADPH supply for improved L-valine formation in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog, 2010, 26(2): 361?371.

[11] Suagee JK, Corl BA, Crisman MV, et al. De novo fatty acid synthesis and NADPH generation in equine adipose and liver tissue. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2010, 155(3): 322?326.

[12] Philippis RD, Ena A, Guastini M, et al. Factor affecting poly-β-hydroxybutyrate accumulation in cyanobactria and in purple-non-sulfur bacteria. FEMS Microbiol Lett, 1992, 103(2/4): 187?194.

[13] Asada Y, Miyake M, Miyake J, et al. Photosynthetic accumulation of poly-(hydroxybutyrate) by cyanobacteria --the metabolism and potential for CO2recycling. Int J Biol Macromol, 1999, 25(1/3): 37?42.

[14] Panda B, Mallick N. Enhanced poly-b-hydroxybutyrate accumulation in a unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Lett Appl Microbiol, 2007, 44(2): 194?198.

[15] Castenholz RW. Culturing methods for cyanobacteria. Meth Enzym, 1988, 167: 68?93.

[16] Beaulieu M, Beaulieu Y, Melinard J, et al. Influence of ammonium salts and cane molasses on growth of alcaligenes eutrophus and production of polyhydroxybutyrate. Appl Environ Microbiol, 1994, 61(1): 165?169.

[17] Muro-Pastor MI, Reyes JC, Florencio FJ. Cyanobacteria perceive nitrogen status by sensing intracellular 2-oxoglutarate levels. J Biol Chem, 2001, 276(41): 38320?38328.

[18] Senior PJ. Regulation of nitrogen metabolism in Escherichia coli and Klebsiella aerogenes: studies with the continuous-culture technique. J Bacteriol, 1975, 123(2): 407?418.

[19] Hein S, Tran H, Steinbüchel A. Synechocystis sp. PCC 6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Archives Microbiol, 1998, 170(3): 162?170.

[20] Mcneely K, Xu Y, Byrant N, et al. Redirecting reductant flux into hydrogen production via metabolic engineering of fermentative carbon metabolism in a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(15): 5032?5038.