let-7家族在腫瘤研究中的進展及前景

許一鳴， 仲崇俊， 肖 平， 沈 亮

miRNAs的主要功能是調節生物體胚胎形成、發育、分化、器官形成、生長和凋亡，調控與疾病發生過程等有關基因的表達。miRNAs表達與多種腫瘤相關，也與腫瘤抑制基因或癌基因有關，其定位于與腫瘤相關的脆性位點，在腫瘤發生過程中起重要作用。

let-7家族是目前研究最為廣泛的miRNAs，在多種腫瘤中的表達是下調的，轉染let-7家族能抑制腫瘤細胞的生長，也有望使腫瘤的基因治療成為可能。

1 let-7家族的特點

1.1 let-7家族的一般特點 let-7是最早發現的一種miRNA，人let-7家族有13個成員，包括let-7a-1,7a-2, 7a-3, 7b, 7c, 7d, 7e, f7-1, 7f-2, 7g, 7i, miR-98和miR-202[1]，是細胞完全分化的標記。let-7家族在鼠和人的胚胎干細胞或干細胞中不能被檢測到，其表達水平在細胞開始分化后增加，在干細胞與干細胞之間通過被抑制表達而扮演發送信號的角色，以維持干細胞自我更新的特點。let-7f在間充質干細胞的衰老過程中表達升高。let-7在人和鼠成體組織器官腦、肺、肝、骨骼肌則保持高水平表達，依賴于脂肪刺激生長因子刺激未分化細胞克隆擴增、細胞周期終止及細胞終末分化，使鼠類脂肪形成。let-7c和 let-7b則在成熟的脂肪細胞中表達上調及維持在較高水平[2]。

1.2 let-7家族在腫瘤形成過程中的特點 像正常干細胞一樣，腫瘤干細胞(慢分化為腫瘤起始細胞)具有無限自我更新和多向分化的潛能，使腫瘤細胞不斷更新增殖及遷移，而let-7家族在腫瘤干細胞中呈低水平表達。不僅如此，在腫瘤的形成過程中，絕大部分let-7家族成員也呈現表達水平降低的變化[3]。let-7靶向調節的癌基因，在成熟組織中不表達，在癌變過程、胚胎形成過程中重新表達是因為失去了let-7的控制，這種程序重排促進去分化和癌的進展，反映腫瘤形成過程即顛倒胚胎形成過程。

1.3 let-7家族與腫瘤的關系 let-7家族絕大部分的表達水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等癌細胞中顯著下調，且肺癌和乳腺癌細胞中let-7a的表達水平與患者的生存時間呈正相關。Chin等[4]從74例非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的KRAS 3′非轉錄區中獲得let-7互補位點(LCS)序列，以觀察變異和單核苷酸多態性與NSCLC的關系，發現LCS6這一多態位點變異型在NSCLC患者中的比例顯著高于正常人群比例，并證實這一多態位點是NSCLC易感性的又一重要因素，表明這一位點的變異可降低let-7的抑癌作用，導致發病率升高，認為let-7對患者預后的評價效果優于傳統標志物,可作為NSCLC的診斷指標。

2 let-7家族與相關因子的調控

let-7家族可以調節細胞周期因子CDC25A和CDK6，及包括RAS 和C-myc16在內的36個增強啟動子,通常結合于基因的3′非轉錄區。實驗證據表明，let-7家族通過與原癌基因RAS、HMGA2和C-myc的3′UTR結合，負調控靶標基因的表達，抑制腫瘤的發生發展[5]。胚胎早期的一些調控基因HMGA2, Mlin-41 和 IMP-1同樣受到 let-7家族的調控[6-7]。

2.1 let-7與HMGA2之間的調控 HMGA2在肺癌、卵巢癌、子宮平滑肌瘤和顱內垂體腺瘤中均高表達，let-7則呈現低表達。在這些腫瘤中，HMGA2 與 let-7表達呈負相關。可以說，在不同的組織中，HMGA2的低表達是因為let-7的高表達[8]。let-7缺失表達有助于某些具有侵襲性的癌重新表達HMGA2。let-7調控HMGA2不僅僅能保持組織的動態平衡，并牽涉到細胞的其他功能。在誘導分化過程中，let-7高表達會減少RAS和 HMGA2的表達，使細胞分化受到抑制及誘導凋亡，因此HMGA2直接受到let-7負調控[6]。

2.2 let-7與Lin-28之間的調控 在哺乳動物的胚胎形成及大腦發育時 let-7表達水平升高，而在胚胎細胞中其表達被Lin-28蛋白阻礙。let-7和Lin-28是let-7雙向負反饋調節環的一部分，Lin-28/Lin-28B和let-7負反饋調節環也包括C-myc。C-myc同樣調節Lin-28B導致let-7受到抑制但不會影響其轉錄的表達，三者共同構成了復雜的負反饋調節環。Lin-28和Lin-28B發揮干細胞因子的作用，Lin-28與其他3個細胞因子Oct4、Sox2、Nanog能有效地使成纖維細胞向多向分化潛能干細胞分化, 在腫瘤細胞和多種干細胞中表達一致上調。Lin-28和Lin-28B在let-7轉錄后調節其活性，通過結合let-7前體的發夾結構及主體部分，抑制其轉錄過程[9]。同時，Lin-28誘導let-7前體表達通過誘導多向分化潛能刺激因子如Pou5F1、Sox2、Nanog和Tlx1來實現。在非小細胞肺癌NCIH446細胞株，提高成熟let-7g的表達可以使Lin-28表達降低。

2.3 let-7與RAS之間的調控 在肺腫瘤組織中let-7的表達要比正常肺組織低，而RAS則相反。let-7負調節let-60/RAS，let-60/RAS包含多個let-7互補結合位點，let-7可通過減少肺癌中RAS的表達水平，調節RET/PTC-RAS-BRAF有絲分裂原蛋白激酶 (MAPK)通路，發揮腫瘤抑制基因的作用，因此，轉染let-7可以抑制MAPK通路的激活。有報道稱在KRAS3′UTR let-7結合位點單核苷酸多態性的改變會導致K-RAS的表達增加，let-7的表達會減少[10]。

2.4 let-7與Dicer之間的調控 let-7同樣可調節Dicer。let-7生物學調控機制或是在Drosha或Dicer水平，或是在進入細胞液之前let-7前體的調節。Dicer的減少不僅對let-7家族產生負面影響，在正常或腫瘤細胞處理其他miRNAs時也會產生廣泛的影響，Tokumaru等[11]報道，Dicer的表達減少有助于NSCLC的診斷。

2.5 let-7與C-myc之間的調控 let-7的調節基因使C-myc在癌細胞中重新表達，let-7的調節基因包括MGA2、IMP-1/CRD-BP和IMP-1，他們通過保持C-myc mRNA的穩定性促進細胞生長，直接調節let-7促進細胞生長和增加細胞的運動性能[6]。抑制let-7的靶基因不僅僅是miRNA單獨活動的結果，轉錄因子C-myc也可被let-7b/c和RNA人抗原R結合蛋白協同抑制，這種調節依賴于和人抗原R與C-myc 3′UTR的結合，導致let-7復合體募集反應緊鄰于let-7靶區[12]。

2.6 let-7與其他調控物之間的調節 NF90-NF45負調節miRNAs的表達，且偏向于調節let-7a，同時也會調節miR-21或其他的miRNAs[13]。E2F2 及CCND2的3′UTR直接約束let-7a, let-7a也下調E2F2及CCND2的表達；Bcl-xL為抗凋亡家族的成員之一，let-7c或let-7g可結合于Bcl-xL mRNA 3′UTR，負調控其轉錄，目前研究表明，只有let-7家族成員能與Bcl-xL mRNA 3′UTR結合[14]。另外，人的肝癌細胞中let-7c低表達，有利于Bcl-xL過度表達，let-7b、let-7g、let-7i、let-7d、let-7a、let-7f、let-7c、let-7e在肝癌Huh7細胞株中是降低的。

3 let-7與癌癥的治療

Landi等[15]證實，let-7可顯著抑制NSCLC細胞的生長。在表達RasGl2D的鼠肺癌細胞系中引入易位表達的let-7g可導致細胞周期停止和細胞死亡。Kumar等[16]經免疫缺陷鼠移植實驗和培養多細胞系肺癌細胞實驗證實，let-7能直接抑制肺癌細胞生長，G12D的活化K-Ras變異對這一效應更敏感，let-7功能的丟失促進了肺腫瘤的形成。let-7作為腫瘤抑制基因可能成為NSCLC治療的靶點。在更多類型的腫瘤細胞株或體內試驗中，let-7的轉染能使腫瘤生長減緩。如let-7g可以通過調節C-myc 和 P16(INK4A)來抑制肝癌細胞的生長[17]。

4 前景和挑戰

let-7家族在眾多癌癥啟始和進程中異常調控的證據提示我們可以在miRNAs系統中尋找基因治療方法。目前，眾多miRNAs靶點及其信號通路的發現，有助于基于miRNAs的靶向治療的發展[18]。當前一項關于locked-nucleic-acid-modified oligonucleotide (LNA-antimiR)的新技術已在寡脫氧核苷酸(ODN)載體方面取得了突破性進展。miRNA藥物(LNA-antimiR-122)第一階段的臨床試驗已于2008年開始，通過antagomirs miRNA藥物抑制特定miRNAs的活性將成為一種可能[19]。

盡管目前取得的進展顯著，腺病毒載體技術的安全問題也有據可查，這為臨床試驗提供了一個很好的平臺[20]。但反義引物或小干擾RNA藥物的發展仍受到自身穩定性、特異性及如何把他們導入細胞等問題的阻礙。把具有抑癌作用的let-7家族用病毒載體引入細胞在獲得廣泛應用之前仍然有許多問題需要解決。只有解決這些問題，自我互補基因組腺病毒載體進入血管后才能方便有效的轉導。

此外，癌癥和miRNAs之間的關系仍沒有完全了解，許多重要的問題依然存在。首先，需要對miRNAs發生改變的基因進行全基因組的分析，對人類不同腫瘤中的拷貝數的改變進行識別，對腫瘤抑制基因或者是致癌miRNAs進行推定等等。同時，還需要更多復雜的體內模型去鑒明miRNAs的具體功能，因為miRNAs可能對轉錄產生廣泛的影響，其生物學特性不太可能被單個或少數蛋白質抑制。目前主要的問題是要明確在腫瘤形成過程中異常表達調節miRNAs的主要作用及與癌癥相關的主要信號轉導通路。為了實現這一目標，更多新的、復雜的、先進的尋找目標靶點的方法將被應用，以便更好地了解正常細胞穩態情況下內源性miRNAs的沉默，明確影響因素及共存的靶點，了解miRNAs是如何調控的，以及在基因表達信號通路中所發揮的作用和扮演的角色。雖然miRNAs只是適度抑制其目標，但他們往往可以發揮強大和廣泛的影響，這主要是他們可以抑制許多基因，并與其他基因表達的調控物一起參與多重反饋回路的調節。有關miRNAs的基因治療靶點的作用應該貫穿整個基因調控網絡，而不是單一的基因產物。一個miRNAs可以調控許多的靶基因，一個miRNAs的改變可能會影響料想不到的基因；相反，單個基因可能受到多個miRNAs的調控，改變其中一個miRNA不足以去影響特定的基因靶點。因此，需要更多的研究來闡明這些問題，使miRNA靶向治療得以成功應用。

[1] Roush S, Slack FJ. The let-7 family of miRNAs[J].Trends Cell Biol,2008, 18(10):505-516.

[2] Sun T, Fu M, Bookout AL,et al . MicroRNA let-7 regulates 3T3-L1 adipogenesis[J].Mol Endocrinol, 2009,23(6):925-931.

[3] O′Hara AJ, Wang L, Dezube BJ,et al. Tumor suppressor miRNAs are underrepresented in primary effusion lymphoma and Kaposi sarcoma[J]. Blood,2009,113(23):5938-5941.

[4] Chin LJ, Ratner E, Leng S, et al. A SNP in a let-7 microRNA complementary site in the KRAS 3′untranslated region increases non-small cell lung cancer risk[J]. Cancer Res,2008,68(20):8535-8540.

[5] Sampson VB, Rong NH, Han J,et al. miRNA let-7a down-regulates MYC and reverts MYC-induced growth in Burkitt lymphoma cells[J].Cancer Res，2007, 67(20):9762-9770.

[6] Boyerinas B, Park SM, Shomron N, et al. Identification of let-7-regulated oncofetal genes[J]. Cancer Res, 2008,68(8):2587-2591.

[7] Maller Schulman BR, Liang X, Stahlhut C, et al. The let-7 miRNA target gene, Mlin41/Trim71 is required for mouse embryonic survival and neural tube closure[J]. Cell Cycle, 2008,7(24):3935-3942.

[8] Nishino J, Kim I, Chada K,et al. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression[J].Cell,2008,135(2):227-239.

[9] Heo I, Joo C, Cho J,et al. Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor MicroRNA[J].Mol Cell,2008,32(2):276-284.

[10] Nelson HH, Christensen BC, Plaza SL,et al. KRAS mutation, KRAS-LCS6 polymorphism, and non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer,2010,69(1):51-53.

[11] Tokumaru S,Suzuki M,Yamada H,et al.let-7 regulates Dicer expression and constitutes a negative feedback loop[J].Carcinogenesis,2008,29(11):2073-2077.

[12] Kim HH, Kuwano Y, Srikantan S,et al. HuR recruits let-7/RISC to repress C-myc expression[J]. Genes Dev,2009,23(15):1743-1748.

[13] Sakamoto S, Aoki K, Higuchi T,et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the MicroRNA processing pathway[J].Mol Cell Biol, 2009,29(13):3754-3769.

[14] Shimizu S, Takehara T, Hikita H,et al. The let-7 family of miRNAs inhibits Bcl-xL expression and potentiates sorafenib-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J]. Hepatol,2010,52(5):698-704.

[15] Landi MT, Zhao Y, Rotunno M,et al. MicroRNA expression differentiates histology and predicts survival of lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2010,16(2):430-441.

[16] Kumar MS, Erkeland SJ, Pester RE, et al .Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 miRNA family[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(10):3903-3908.

[17] Roy S, Soh JH, Gao Z. A microfluidic-assisted microarray for ultrasensitive detection of miRNA under an optical microscope[J]. Lab Chip,2011,11(11):1886-1894.

[18] Cho WC. miRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy[J]. Int J Biochem Cell Biol,2010,42(8):1273-1281.

[19] Elmen J, Lindow M, Schütz S,et al. LNA-mediated miRNA silencing in non-human primates[J]. Nature, 2008 ,452(7189):896-899.

[20] Kota J, Chivukula RR, O’Donnell KA,et al. Therapeutic miRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model[J]. Cell,2009,137(6):1005-1017.