啟動子區域甲基化狀態對THP－1細胞腫瘤壞死因子α分泌的影響

郭 堯， 楊智勇， 王春友

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺病研究所，湖北武漢430022)

腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF－α)最早于1975年被發現，是由活化的單核細胞產生的一種能使腫瘤發生出血壞死的物質［1］。在對TNF－α研究后發現，TNF－α是一種重要的炎癥因子，促進炎癥的發生和發展［2］。在多種因素的刺激作用下，TNF－α可以快速地表達分泌，在數小時后就可以達到分泌高峰水平［3，4］。TNF－α的表達調控是一個復雜的過程，包括轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平等等［5］。脊椎動物DNA甲基化最顯著的特征是在基因組的某些區域內，富含密度較高的CpG雙核苷酸結構，即CpG島［6］。CpG島結構廣泛存在于各種組織細胞基因中，在基因表達調控中起著重要作用［7］。TNF－α基因啟動子區域無典型CpG島結構，但有散在的CpG雙核苷酸，這些CpG雙核苷酸結構與核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)、cAMP應答元件(cyclic AMP response element，CRE)、AP－1、Sp1、AP －2等一些重要的轉錄因子結合位點相鄰或關系密切［8］。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人單核細胞系THP－1細胞，對不同時點TNF－α表達水平與其基因啟動子區域甲基化狀態進行了研究，探討TNF－α基因啟動子區域散在CpG雙核苷酸結構的甲基化狀態與基因表達調控之間的關系。

材料和方法

1 材料

人單核細胞系THP－1細胞購于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。RPMI－1640液體培養基購于Gibco，4℃保存。胎牛血清購于Gibco，－20℃保存。LPS購于Sigma。TNF－α酶聯免疫分析(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于武漢博士德公司。DNA提取試劑盒購于Promega。甲基化轉化試劑盒購于Qiagen。DNA純化回收試劑盒購于TaKaRa。

2 方法

2.1 細胞培養 THP－1細胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液中，置于含5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞培養至對數生長期時開始用于實驗。

2.2 TNF－α分泌峰值測定 使用終濃度為1 mg/L LPS刺激不同樣本THP－1細胞，每個樣本的細胞濃度為1.0 × 109cells/L。分別刺激 0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。收集細胞培養液，以 1 000 r/min離心5 min，取上清液，通過ELISA方法測定TNF－α蛋白分泌量，每個樣本做雙份測定。實驗重復4次，結果以刺激不同時間的分泌量與未刺激時分泌量比值的均數±標準誤(±sE)表示。使用方差分析對不同時間點分泌量進行統計學評估。

2.3 DNA甲基化轉化 將培養細胞分為3組。對照組:細胞不使用任何炎癥介質刺激。1 mg/L LPS(4 h)組:細胞使用1 mg/L LPS刺激4 h。1 mg/L LPS(8 h)組:細胞使用1 mg/L LPS刺激8 h。刺激時間結束后，使用DNA提取試劑盒，分別從每組細胞中提取基因組DNA。提取的DNA采用紫外分光光度計測定其濃度和純度。使用甲基化轉化試劑盒，對所提取基因組DNA進行甲基化轉化。該試劑盒采用重亞硫酸鹽轉化法。轉化后分別純化回收每組樣本DNA。

2.4 PCR擴增 分別對每組甲基化轉化后的基因組DNA進行PCR擴增。針對TNF－α啟動子區域設計甲基化PCR擴增引物。正向引物5＇－ccaaaagaaatggaggcaatag－ 3＇，逆向引物 5＇－ gaccagctaagagggagagaag－3＇。擴增產物為啟動子區域－344到+57位點。PCR擴增后，對其進行瓊脂糖凝膠電泳。使用DNA純化回收試劑盒對凝膠電泳后每組DNA片段分別進行純化回收。

2.5 轉化及篩選 將純化回收的甲基化轉化后DNA片段通過TA連接進入T載體，連接后將載體轉化到感受態細菌，接種于新制含氨芐西林、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－D－galactopyranoside，X－gal)和異丙基硫代－β－D－半乳糖苷(isopropyl β－D－thiogalactoside，IPTG)的LB瓊脂培養板，于37℃恒溫培養箱中培養。24 h后取出培養板，挑選單克隆白色菌落再次接種于新制LB瓊脂培養板，于37℃恒溫培養箱中培養。24 h后挑選單克隆白色菌落于LB液體培養基中搖菌過夜。

2.6 基因測序 細菌培養后，送新鮮菌液進行DNA測序。每組樣本選取5個克隆送Invitrogen公司測序。每組樣本測序結果以CpG雙核苷酸結構甲基化數占擴增區域總CpG雙核苷酸結構數的百分率表示。采用χ2檢驗比較間差異。

結 果

1 LPS刺激下THP－1細胞TNF－α的表達變化

使用終濃度為1 mg/L LPS刺激THP－1細胞。培養液上清TNF－α分泌水平在刺激后2 h明顯升高。刺激4 h達到分泌高峰，濃度為未刺激時的(48.9±1.06)倍，與未刺激時相比明顯升高(P＜0.01)。4 h后開始下降，刺激8 h有明顯降低，濃度為未刺激時的(36.30±1.65)倍，與刺激4 h時相比明顯下降(P＜0.01)，見圖1。各組甲基化率與相應時點TNF－α分泌量比值之間呈明顯負相關(r=－0.99，P＜0.01)。

Figure 1.The secretion level of TNF－α in LPS－stitmulatedTHP－1 cells.THP －1 cells were stimulated with 1mg/L LPS for the indicated time.The data were presented as ratios relative to unstimulated cells(0 h).±sE.n=4.＊＊P ＜0.01 vs 0 h;△△P ＜0.01 vs 4 h.圖1 LPS刺激下THP－1細胞培養液上清TNF－α濃度的變化

2 TNF－α基因啟動子區域DNA甲基化分析

基因測序結果表明，未受LPS刺激的THP－1細胞，其TNF－α基因啟動子－344 bp到轉錄起始位點(transcription start site，TSS)區域內，11個CpG雙核苷酸結構均處于甲基化狀態，見圖2B。1 mg/L LPS刺激4 h后，TNF－α基因啟動子－344 bp到TSS區域內11個CpG雙核苷酸結構中，僅有4個仍處于甲基化狀態。其中－119、－72、－49、－38等幾個與轉錄因子(transcription factor，TF)結合位點相鄰或關系密切的位點，其CpG雙核苷酸結構已去甲基化，見圖2C。1 mg/L LPS刺激8 h后，該區域內11個CpG雙核苷酸結構中，有9個處于甲基化狀態。其中－238、－169、－163、－161、－119、－72、－49等幾個位點開始恢復甲基化狀態，－146和－38位點處于去甲基化狀態。－119、－72、－49等幾個與TF結合位點相鄰或關系密切的位點，其CpG雙核苷酸處于甲基化狀態，見圖2D。

Figure 2.The TNF － α promoter fragment ranging from －344 bp to TSS was analyzed by bisulfite sequencing.Filled black circles represent≥80%methylation at a given CpG after sequencing 5 individual clones.Open circles represent＜20%methylation at a given CpG.Half－filled black circles represent between 20%and 80%methylation at a given CpG.A:the fragment contains 11 CpG dinucleotides(arrow:↑)and the TF binding sites for AP －1，AP －2，Sp1，NF － κB as well as cAMP response element(CRE)and TATA box;B:methylation status of gene promoter in unstimulated THP－1 cells;C:methylation status of gene promoter in 4 h LPS－stimulated THP－1 cells;D:methylation status of gene promoter in 8 h LPS－stimulated THP－1 cells.圖2 TNF－α基因啟動子－344 bp到TSS區域甲基化狀態

TNF－α基因啟動子區域測序結果表明，CpG雙核苷酸結構平均甲基化率，對照組為100%;1 mg/L LPS(4 h)組為21.8%;兩者之間差異顯著(P＜0.01)。CpG雙核苷酸結構平均甲基化率，1 mg/L LPS(8 h)組為41.8%，與1 mg/L LPS(4 h)組之間差異顯著(P＜0.05)。

討 論

基因序列中存在的CpG雙核苷酸結構，其甲基化狀態對基因的表達調控有重要作用［5，8，9］。脊椎動物DNA甲基化最顯著的特征是富含CpG島，即在基因組的某些區域內，富含密度較高的CpG雙核苷酸結構［6］。DNA甲基化影響基因表達的一個機制是甲基化CpG結構直接影響TF與啟動子區域結合，從而抑制轉錄［10］。查找TNF－α基因序列，發現其啟動子區域無典型CpG島結構。此次實驗采用基因測序法研究TNF－α基因啟動子－344 bp到+57 bp區域，其中－344 bp到TSS區域內含11個散在的CpG雙核苷酸結構。此區域內還含有NF－κB、CRE、AP－1、Sp1、AP－2等關鍵 TF結合位點，見圖 2A。其中，－119、－72、－49、－38等幾個位點的 CpG 雙核苷酸結構與這些TF結合位點相鄰或關系密切。因此此區域DNA甲基化狀態可能在TNF－α的表達調控中起著重要作用。

目前，對DNA甲基化的研究方法主要有甲基化特異性PCR法、限制性內切酶甲基化分析法、重亞硫酸鹽甲基化測序法等，其中以重亞硫酸鹽測序法最為可靠和直觀［11］。本次實驗采用重亞硫酸鹽轉化基因測序法對LPS刺激的THP－1細胞進行研究。

本研究測定的THP－1細胞TNF－α基因啟動子區域含有11個CpG雙核苷酸結構，未受刺激時均處于甲基化狀態。在受到LPS刺激后，TNF－α分泌在4 h達到高峰。此時，所測序的5個克隆中，甲基化率達到或高于80%的位點只有1個，甲基化率介于20%到80%之間的只有3個，其余均處于去甲基化狀態，整體甲基化水平最低，提示TNF－α基因表達增高與其啟動子區域去甲基化狀態有關。在LPS刺激8 h后，TNF－α分泌已開始降低，其基因啟動子區域的11個CpG雙核苷酸結構已開始部分恢復甲基化狀態，甲基化率達到或高于20%的位點有9個，其中甲基化率達到或高于80%的有2個，只有2個位點為去甲基化狀態，1個位點繼續保持去甲基化。

總體上來看，當TNF－α基因啟動子區域散在的CpG雙核苷酸結構甲基化水平較高時，基因不表達或低表達;當其甲基化水平較低時，基因高表達。TNF－α分泌量與TNF－α啟動子區域整體甲基化水平呈明顯負相關。從每一個CpG雙核苷酸位點情況來看，－238、－169、－163、－161、－119、－72和－49這幾個位點的甲基化率與TNF－α分泌量相關性和整體水平一致。－119、－72和－49位點與部分重要TF結合位點相鄰或關系密切，因此可能通過影響 TF與啟動子區域結合，從而抑制轉錄。而－303、－146和－38這3個位點甲基化率與TNF－α分泌量無明顯相關性，其機制值得進一步研究。

TNF－α是參與炎癥反應的重要因子。TNF－α通過刺激血管內皮細胞表達黏附分子，使之易黏附于白細胞，刺激免疫細胞產生趨化因子，引起白細胞在炎癥部位聚集，產生炎癥反應［12］。TNF－α基因的表達，受多種因素的調控。近年來對TNF－α基因的表達調控研究較多的，是各種炎癥介質的影響，以及各種信號轉導通路的作用［3，4］。當細胞受到內毒素或其它一些炎癥介質刺激時，相關轉錄因子與TNF－α基因啟動子區域特異性位點結合，使TNF－α基因轉錄開始或上調，表達TNF－α［13］。除基因本身的改變外，表觀遺傳方式對TNF－α的表達調控作用還并不十分清楚。此次實驗結果顯示，不同TNF－α表達水平與其基因啟動子區域甲基化水平具有負相關性。TNF－α基因啟動子區域的甲基化狀態是否直接導致基因表達的改變，如果直接導致其改變又是通過何種具體機制影響基因的表達值得進一步研究。

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