巨噬細胞移動抑制因子經Rho途徑促進人肺成纖維細胞III 型膠原合成*

陳培芬， 羅雅玲， 賴文巖， 邢曉雯， 駱子義， 邱智輝

(深圳市第三人民醫院1 內科，5胃鏡室，廣東 深圳518110;南方醫科大學附屬南方醫院2 呼吸科，3心內科實驗室，廣東 廣州510515;4廣州醫學院附屬第一醫院心內科，廣東 廣州510120)

氣道重塑是哮喘具有特征性的病理改變之一。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由I、III、V 型膠原纖維和成肌纖維細胞產生的纖維連接蛋白組成［1］。其中，Ⅲ型膠原的增生也是細胞外基質沉積的主要病理基礎［2］。

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是體內一種重要的多功能細胞因子，具有促炎、免疫調節等功能。新近的研究提示MIF 在氣道重塑中起重要作用［3］，但其機制未明。本研究探討了MIF 在人胚肺成纖維細胞合成Ⅲ型膠原中可能的作用及其途徑，以初步探討MIF 在氣道重塑中的機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

DMEM 培養基購自Gibco;胎牛血清為PAA 產品;recombinant MIF(rMIF)購自R＆D;Trizol RNA 抽取試劑為Invitrogen 產品，逆轉錄試劑盒購自Fermentas;鼠抗人Ⅲ型膠原抗體購自Santa Cruz;HRP -兔抗鼠IgG(II 抗)購自北京博奧森生物技術有限公司;Rho 激酶抑制劑Y27632 購自BioSource;PCR 引物由上海英駿公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 人胚肺成纖維細胞株MRC-5(購自中國科學院上海細胞生物學研究所)培養于DMEM 培養液中，培養液中加入10%胎牛血清，細胞在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。實驗分為實驗組和對照組，實驗組分別加入不同濃度的rMIF(25-100 μg/L)。

2.2 RT-PCR 方法檢測Ⅲ型膠原mRNA 的表達

使用6 孔板，對照組和實驗組孵育完成后收集細胞，用Trizol 提取總RNA，紫外分光光度計檢測純度。反應分2 步進行:取5 μL 總RNA，在M-MLV 逆轉錄酶作用下合成cDNA;取1 μL 逆轉錄產物進行PCR 擴增反應。Ⅲ型膠原上游引物為5'-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3'，下游引物為5'-AGCAGTTGGAGGCTGTGGG-3'，產物大小257 bp;GAPDH 上游引物為5' - ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'，下游引物為5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產物大小450 bp。PCR 反應條件如下:94℃預變性5 min，94℃1min，53℃45 s，72℃1 min，進行36 個循環，最后72℃10 min。實驗重復3 次。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外透射反射儀觀察擴增產物的大小及亮度并攝影。使用IPP6.0 圖像分析軟件對擴增條帶進行分析，以平均灰度值代表相應基因的表達量，并除以GAPDH 灰度值，所得數值作為各擴增產物mRNA 的相對表達量。

2.3 Western blotting 檢測III 型膠原蛋白表達 用預冷PBS 洗細胞3 次，加入200 μL 蛋白裂解液，刮起細胞，4 ℃12 000 × g，離心15 min，吸取上清，BCA 法測定總蛋白濃度。取40μg 的上述樣品加樣至15% SDS-PAGE 凝膠，電泳，待溴酚藍接近凝膠底部時停止電泳，用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至硝酸纖維膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入1∶ 500 稀釋的鼠抗人III 型膠原抗體及β-actin 單克隆抗體，于4℃孵育12 h，然后加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜后用ECL 液顯影，以β -actin 為內參照，用IPP 6.0 圖像分析軟件對III 型膠原蛋白進行半定量分析。

3 統計學處理

結 果

1 rMIF 對MRC－5 細胞III 型膠原mRNA 轉錄的影響

如圖1 所示，rMIF 刺激人MRC -5 細胞后48 h，呈劑量依賴地促進III 型膠原mRNA 表達(P ＜0.01)。

Figure 1. rMIF induces collagen type III (Col III)mRNA synthesis in MRC-5 fibroblasts. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ##P ＜0.01 vs control (0 μg/L).圖1 不同濃度rMIF 刺激MRC－5 細胞III 型膠原mRNA表達

2 rMIF 對MRC－5 細胞III 型膠原蛋白表達的影響

如圖2 所示，rMIF 刺激人MRC - 5 細胞后48 h，呈劑量依賴地誘導III 型膠原蛋白表達(P ＜0.01)。

Figure 2. rMIF induces collagen type III (Col III)protein expression in cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ± s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 μg/L).圖2 不同濃度rMIF 促進MRC－5 細胞III 型膠原蛋白合成

3 拮抗Rho 激酶抑制III 型膠原mRNA 表達

如圖3 所示，加入Rho 拮抗劑后可顯著抑制rMIF 誘導的III 型膠原mRNA 合成(P ＜0.01)。

4 拮抗Rho 激酶抑制III 型膠原蛋白表達

如圖4 所示，加入Rho 拮抗劑后可顯著抑制rMIF 誘導的III 型膠原蛋白表達(P ＜0.01)。

討 論

細胞因子MIF 具有廣泛的生物學功能如酶學功能、免疫調節功能。研究表明，MIF 可促進NIH3T3細胞增殖［4］，刺激血管平滑肌細胞合成I、III 型膠原mRNA 和I 型膠原蛋白，從而參與高血壓血管重構［5］，與動脈內膜增厚有關［6］。提示MIF 在細胞增殖和膠原合成中具有重要作用。哮喘患者MIF 表達增加，是哮喘發病的關鍵因素［7-10］。而且MIF 可能誘導二異氰酸酯哮喘患者肺泡盥洗液中基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP - 9)表達［11］，MMP -9 在哮喘氣道重塑中起重要作用。新近的研究也提示MIF 參與氣道重塑［3］，但機制未明。

Figure 3. Effect of Y27632 on Col III mRNA expression in rMIF-stimulated MRC-5 cells. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 Y27632 對rMIF 刺激的MRC－5 細胞III 型膠原mRNA 表達的影響

Figure 4. Effect of Y27632 on Col III protein expression in rMIF- stimulated MRC - 5 cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ±s. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 Y27632 對rMIF 刺激的MRC－5 細胞III 型膠原蛋白表達的影響

作為氣道黏膜下的主要結構細胞之一，成纖維細胞(fibroblast，FB)的增殖和積聚可使氣道壁增厚，管腔狹窄;并且FB 產生的膠原纖維、彈性纖維和網狀纖維等沉積于基底膜，使氣道壁進一步增厚。Ⅲ型膠原的增生成為細胞外基質沉積的主要病理基礎［2］。有研究認為Ⅲ型膠原沉積是哮喘開始氣道重塑的標志［12］。因此我們進一步探討了MIF 與Ⅲ型膠原合成之間的關系。本研究結果表明，rMIF 可呈濃度依賴性促進Ⅲ型膠原mRNA 和蛋白表達。這提示MIF 可能通過促進成纖維細胞Ⅲ型膠原合成而參與哮喘的氣道重塑。這與本研究的前期結果MIF 可促進MRC-5 增殖和I 型膠原合成是一致的［13］。

MIF 導致MRC-5 細胞膠原表達增多的機制尚不清楚。最近發現，MIF 可激活Rho 激酶途徑［4］，而Rho 激酶在調控血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細胞增殖與膠原合成中具有重要作用［14］。大量研究提示Rho 激酶途徑是哮喘氣道重塑中的一條重要通路。Rho 抑制劑可抑制G 蛋白偶聯受體(G protein -coupled receptor，GPCR)激動劑溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)誘導的人氣道平滑肌細胞增殖，而且也抑制LPA 與表皮生長因子的協同作用［15］。有研究表明1 -磷酸鞘氨醇引起人肺成纖維細胞WI38 向成肌纖維細胞表型轉化也是通過Rho激酶途徑介導的［16］。

Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho -associated - coiled coil forming protein kinase，ROCK)是Rho 蛋白的下游靶效應分子之一。Y27632 是在細胞生物學和藥理學研究中廣為應用的ROCK 抑制劑。本研究在rMIF 刺激MRC -5 細胞前預先用Y27632處理，觀察其對rMIF 促進膠原表達的影響。結果顯示，rMIF 誘導MRC-5 細胞III 型膠原表達的能力可被Y27632 所抑制。由于Y27632 只特異性作用于Rho 激酶，因此本結果提示Rho 激酶信號通路參與了rMIF 誘導的MRC-5 細胞III 型膠原合成。

［1］ Elias JA，Zhu Z，Chupp G，et al. Airway remodeling in asthma［J］. J Clin Invest，1999，104(8):1001 -1006.

［2］ Wills -Karp M，Luyimbazi J，Xu X，et al. Interleukin -13:central mediator of allergic asthma［J］. Science，1998，282 (5397):2258 -2261.

［3］ Chen PF，Luo YL，Wang W，et al. ISO -1，a macrophage migration inhibitory factor antagonist，inhibits airway remodeling in a murine model of chronic asthma［J］.Mol Med，2010，16(9 -10):400 -408.

［4］ Swant JD，Rendon BE，Symons M，et al. Rho GTPase -dependent signaling is required for macrophage migration inhibitory factor-mediated expression of cyclin D1［J］. J Biol Chem，2005，280(24):23066 -23072.

［5］ 李 軍，林曙光，余細勇，等. 巨噬細胞移動抑制因子對血管平滑肌細胞膠原I、III mRNA 體外表達的影響［J］. 第一軍醫大學學報，2005，25(6):684 -686.

［6］ Korshunov VA，Nikonenko TA，Tkachuk VA，et al. Interleukin-18 and macrophage migration inhibitory factor are associated with increased carotid intima-media thickening［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(2):295 -300.

［7］ Kobayashi M，Nasuhara Y，Kamachi A，et al. Role of macrophage migration inhibitory factor in ovalbumin - induced airway inflammation in rats［J］. Eur Respir J，2006，27(4):726 -734.

［8］ Amano T，Nishihira J，Miki I. Blockade of macrophage migration inhibitory factor (MIF)prevents the antigen -induced response in a murine model of allergic airway inflammation［J］. Inflamm Res，2007，56(1):24 -31.

［9］ Magalh?es ES，Mourao -Sa DS，Vieira -de -Abreu A，et al. Macrophage migration inhibitory factor is essential for allergic asthma but not for Th2 differentiation［J］. Eur J Immunol，2007，37(4):1097 -1106.

［10］ Robroeks CM，Rijkers GT，J?bsis Q，et al. Increased cytokines，chemokines and soluble adhesion molecules in exhaled breath condensate of asthmatic children［J］. Clin Exp Allergy，2010，40(1):77 -84.

［11］ Piiril? P，Lauhio A，Majuri ML，et al. Matrix metalloproteinases-7，-8，-9 and TIMP-1 in the follow-up of diisocyanate - induced asthma［J］. Allergy，2010，65(1):61 -68.

［12］ Wilson JW，Li X.The measurement of reticular basement membrane and submucosal collagen in the asthmatic airway［J］. Clin Exp Allergy，1997，27(4):363 -371.

［13］ 陳培芬，羅雅玲，賴文巖，等.巨噬細胞移動抑制因子促進肺成纖維細胞增殖和膠原合成［J］. 中國病理生理雜志，2009，25(4):699 -702.

［14］ 汪祥海，伍 衛，楊 軍，等.Rho 激酶在血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成中的作用［J］. 中國病理生理雜志，2007，23(6):1098 -1110.

［15］ Ediger TL，Schulte NA，Murphy TJ，et al. Transcription factor activation and mitogenic synergism in airway smooth muscle cells［J］. Eur Respir J，2003，21(5):759 -769.

［16］ Urata Y，Nishimura Y，Hirase T，et al. Sphingosine 1 -phosphate induces alpha -smooth muscle actin expression in lung fibroblasts via Rho-kinase［J］. Kobe J Med Sci，2005，51(1 -2):17 -27.