我國甲病毒的分離與鑒定

李文娟,王志玉,梁國棟

甲病毒是指披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(A lphavirus)病毒,是一類以蚊蟲等吸血節(jié)肢動物為傳播媒介,引起人畜疾病的重要病原體。國際病毒分類委員會2009年第9次報告確認目前共發(fā)現(xiàn)29種甲病毒,其中有l(wèi)3種可引起人、畜疾病,至少9種發(fā)生過人間流行[1-2]。自上世紀80年代以來,隨著我國蟲媒病毒研究的發(fā)展,相繼分離到多種甲病毒;在人群和動物中檢測到多種甲病毒抗體;并且發(fā)現(xiàn)多例甲病毒感染的輸入性病例[3]。甲病毒研究在我國蟲媒病毒研究領(lǐng)域取得了較大進展。本文就近30年來我國甲病毒研究進展進行綜述。

1 辛德畢斯病毒(Sindbis virus,SINV)

1987年,在云南省發(fā)熱病人的血清標本中分離到 YN87448病毒[4];1990年,從新疆自治區(qū)的按蚊中分離到XJ-160病毒[5];2005年,從云南省的三帶喙庫蚊中分離到MX10病毒[6]。經(jīng)血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定,YN87448、XJ-160和MX10病毒均為 SINV。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),XJ-160病毒在SINV古北區(qū)/埃塞俄比亞基因型中形成單獨的進化分枝,提示XJ-160病毒是該基因型的新亞型[5]。YN87448病毒與SINV南非分離株S.A.AR86全部非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸同源性為98.8%,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸同源性為99%,二者的親緣關(guān)系最近,但是在生物學(xué)特性上存在較大差異:S.A.AR86能使成年小鼠產(chǎn)生神經(jīng)癥狀而導(dǎo)致死亡,而 YN87448不會致成年小鼠死亡,序列分析提示,YN87448在非結(jié)構(gòu)基因的乳白突變和核苷酸缺失可能導(dǎo)致其毒力下降[7-8]。MX10病毒與 SINV馬來西亞分離株MRE16、YN87448、XJ-160的 E1基因核苷酸同源性分別為90.0%、73.1%、72.0%;進化分析顯示,MX10病毒屬于SINV澳大利亞/東方型。

XJ-160病毒1990年分離后,在分子生物學(xué)方面開展了較為深入的研究。通過對XJ-160病毒全基因組序列測定和分析,闡明了該病毒基因組與其他SINV之間的差異,明確XJ-160病毒屬于辛德畢斯樣病毒(Sindbis-Like virus)[5]。發(fā)現(xiàn) XJ-160病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因可引起宿主細胞的凋亡[9];外源導(dǎo)入的siRNA通過降解病毒RNA抑制XJ-160病毒的復(fù)制,并且具有明顯的序列特異性、位置效應(yīng)和量效關(guān)系[10]。完成了XJ-160病毒的感染性全基因組cDNA克隆的構(gòu)建,并利用感染性克隆進一步構(gòu)建了具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的XJ-160病毒復(fù)制子型表達載體[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),XJ-160病毒的 nsP1基因第 565和 577位核苷酸(對應(yīng) 169Lys和173Thr)突變與否直接影響到全基因克隆的感染性,并構(gòu)建了穩(wěn)定表達XJ-160病毒全部結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細胞系BHK-21E+Capsid,證實了 E2蛋白尤其是145-150位氨基酸與硫酸肝素的相互作用在SINV感染細胞過程中起到?jīng)Q定性作用[13-15]。一些研究結(jié)果發(fā)表在國際雜志,使我國甲病毒的研究躋身國際行列。

血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在我國多個省市存在SINV抗體陽性人群[16]。云南省健康人群和發(fā)熱病人中均存在SINV抗體[17];當(dāng)?shù)匾笆笾幸矙z測到SINV抗體[17];海南省、廣東省和福建省也存在SINV抗體陽性人群和動物[18-19];福建省從病毒性腦炎患者血清和腦脊液中檢測到 SINV IgG抗體[20],提示SINV可能是我國病毒性腦炎的病原體之一。

SINV是甲病毒屬的代表株,l952年首次分離于埃及尼羅河三角洲地區(qū)的單條庫蚊,SINV對人類不僅可引起發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)炎等癥狀,而且引起的疾病能夠發(fā)展為慢性疾病[21],該病在非洲、北歐、亞洲等地均有流行,尤其是在芬蘭,每隔7年發(fā)生一次暴發(fā)流行,對當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生產(chǎn)生嚴重影響[22]。

2 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)

1986年,從云南省的蝙蝠腦組織中分離到1株病毒(B8635)[23],蚊蟲標本中分離到 3株病毒(M26,M80,M81)[24]。1993年,在海南省采集的蝙蝠和致倦庫蚊中分離到2株病毒(HN36,HN24)[25]。經(jīng)血清學(xué)檢測,上述6株病毒對標準CHIKV抗體的中和效價分別為320、1 000、6 761、676、1 000和1 585[23-25],提示這些病毒為CHIKV,但是迄今尚未對這些病毒株進行分子生物學(xué)鑒定。

血清流行病學(xué)調(diào)查,云南省健康人群中CHIKV抗體陽性率為 9.23%,部分地區(qū)高達43.78%[17];而在海南省、廣東省等地人群中也檢測到CHIKV抗體[18]。多種野生動物和家畜中也存在CHIKV抗體,其中以云南省棕果蝠的陽性率最高,達49.30%,其次為鳥類的36.84%,推測這些動物可能在病毒的自然循環(huán)中發(fā)揮一定作用[18,23]。這些結(jié)果提示我國人群和動物中存在 CHIKV感染。

截至目前,在我國尚無基孔肯雅病流行的報道,但是輸入性病例時有發(fā)生。2008年3月,在廣州市發(fā)現(xiàn)2名由來自斯里蘭卡的基孔肯雅病的輸入性病例;2008年10月,廣東省茂名市發(fā)現(xiàn)2名來自馬來西亞的輸入性病例;2008年11月,在廣州市發(fā)現(xiàn)了1名來自馬來西亞的輸入性病例[3]。通過RT-PCR從上述5例病人血清中檢測到CHIKV的 E2基因序列,并從其中4例患者血清標本中得到CHIKV全基因組序列,系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),這也4條全基因組序列均位于CHIKV印度洋基因型分支內(nèi);這也是我國首次從輸入性病例標本中分離到CHIKV的報道[3]。

CHIKV在分類上屬于甲病毒屬西門里克森林腦炎病毒抗原復(fù)合群成員,1953年首次分離自烏干達1例發(fā)熱病人血清標本。對人類主要引起發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹和輕度出血等癥狀[26]。該病主要流行于非洲和東南亞地區(qū),近年來在東非海岸、印度洋島嶼、印度及東南亞地區(qū)也多次發(fā)生爆發(fā)流行,已成為世界上流行范圍最廣的甲病毒[27]。

3 羅斯河病毒(Ross river virus,RRV)

1993年,在海南省三亞市捕獲的蝙蝠腦組織中分離到1株病毒(HBb17)[28]。HBb17病毒在實驗條件下能在蚊體內(nèi)復(fù)制,并通過蚊媒傳播使小鼠發(fā)病死亡。經(jīng)血清學(xué)檢測,HBb17病毒與RRV的抗原性最接近[28]。序列測定及分析顯示,HBbl7株與RRV(國際標準株 T48病毒)在3′U TR(un-translated region)核苷酸同源性為99%,結(jié)構(gòu)基因 E1核苷酸同源性為99%,系統(tǒng)進化分析顯示,HBb17病毒與RRV處在同一進化分支,表明 HBb17病毒分離株為RRV29],這是國內(nèi)首次報道分離到RRV。

血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在海南省健康人群中RRV抗體陽性率為3.07%,且集中在瓊中和三亞地區(qū),當(dāng)?shù)匕l(fā)熱病人中 RRV抗體陽性率則達到8.70%,但是同處于南方的廣東省人群中則沒有檢測到 RRV抗體[18]。在海南省野鼠中也檢測到RRV抗體[18,28]。由于 HBbl7病毒分離株來自海南省捕獲的蝙蝠標本,并且在海南省健康人群、發(fā)熱病人和野鼠中均檢測到RRV抗體,提示該病毒可能在海南省形成自然循環(huán),并可能是引起當(dāng)?shù)厝巳喊l(fā)熱的病原,但迄今未見病毒再分離的報道。

RRV是屬于甲病毒屬西門里克森林腦炎病毒抗原復(fù)合群,1963年首次分離自澳大利亞東部海岸平原地區(qū);對人類可引起全身性疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大,主要流行于澳大利亞和西南太平洋地區(qū)[30]。

4 蓋塔病毒(Getah virus,GETV)

1964年,在海南省的庫蚊中分離到1株病毒(M1),實驗條件下M1株能在埃及伊蚊和致倦庫蚊中增殖,且新生小白鼠被感染M1株的埃及伊蚊叮咬后,骨骼肌發(fā)生退化、萎縮、壞死和肌纖維的炎癥改變,經(jīng)分子生物學(xué)鑒定M1為 GETV[31],此后相繼在河北省分離到 2株 GETV(HB0234,HB0215)[32],云南省分離到2株 GETV(YN0540,YN0542),上海市分離到 4株 GETV(SH05-5,SH05-15,SH05-16,SH05-17),甘肅省分離到1株GETV(GS10-2)[33]。病毒核酸序列分析顯示我國分離的 GETV進化關(guān)系很近,形成一個相對獨立的類群。進一步的分析發(fā)現(xiàn),我國分離的 GETV存在特有的序列特點,其進化關(guān)系與分離年代相關(guān)[33]。

血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,云南省健康人群中GETV抗體陽性率為3.20%,恒河猴中也存在GETV抗體[17];海南省健康人群和發(fā)熱病人中均檢測到 GETV抗體,陽性率分別為10.3%和26.4%,并且豬、馬、羊等家畜的 GETV抗體陽性率也很高(17.6%～37.5%)[31];而從外地來海南省的駐軍人員中GETV抗體明顯低于當(dāng)?shù)厝巳篬34],提示在海南省當(dāng)?shù)卮嬖贕ETV的流行。

GETV為甲病毒屬西門里克森林腦炎病毒抗原復(fù)合群成員。1955年,GETV首先從馬來西亞的霜背庫蚊中分離到[35]。廣泛流行于東南亞地區(qū),馬來西亞、印度、巴基斯坦、日本等國家均報道有GETV感染。GETV對馬可以引起發(fā)熱、蕁麻疹和后肢水腫,孕豬感染后會引起流產(chǎn),在人血清中檢測到GETV的中和抗體,但是對人尚未有引起疾病的報道[33]。

5 馬雅羅病毒(Mayaro virus,MAY V)

1985年,從云南省的蚊蟲和發(fā)熱病人中分離到11株病毒,其中10株分離自蚊蟲,1株分離自發(fā)熱病人血清標本;酶免疫法顯示,這11株病毒均與甲病毒屬抗體反應(yīng),尤其與MA YV反應(yīng)最強,而交叉中和試驗則與MA YV無交叉中和反應(yīng),提示這11株病毒與MA YV抗原性相關(guān)[36]。1985年,在海南省采集的蚊蟲中分離到2株病毒(HN8,HN99);交互快速微量中和試驗表明,這2株病毒只與甲病毒屬抗體反應(yīng),尤其與MA YV的抗原性最為密切[37]。1995年,從海南省捕獲的蚊蟲標本中分離到1株病毒(HYM1);交叉血凝抑制試驗和交互中和試驗表明,HYM1與MA YV抗原性關(guān)系密切[38]。上述病毒通過血清學(xué)初步鑒定為MA YV,但是未見這些病毒基因序列測定和后續(xù)病毒分離的報告。

血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在海南省的健康人和多種家畜血清中均檢測到MA YV抗體[37-38];而在駐海南省官兵中則未檢及[34],這可能與當(dāng)?shù)厝巳洪L期居住,受感染的機會比較到多,而駐地官兵多來自外省,服役時間短,感染機會相對較少有關(guān)。

MA YV在甲病毒分類中屬于西門里克森林腦炎病毒抗原復(fù)合群成員,可引起急性傳染病,以發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹為特征。1954年,MA YV首先在特立尼達Mayaro的發(fā)熱病人血清中分離到。廣泛分布于南美洲熱帶森林地區(qū),在特立尼達、玻利維亞和巴西曾發(fā)生過爆發(fā)流行[39]。

6 東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus,EEEV)

1992年,從新疆博爾塔拉地區(qū)采集的全溝硬蜱中分離到1株病毒(XJ-91031)[40]。EEEV抗體對XJ-91031病毒的中和指數(shù)可達1000,初步鑒定XJ-91031病毒為 EEEV[41]。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在多個省市的人群中檢測到 EEEV抗體[16]。2000-2002年,福建省15例病毒性腦炎患者中檢測到 EEEV的IgG抗體[42]。

EEEV于1933年首次分離自美國東部病死的馬腦,主要分布在美洲。EEEV主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),表現(xiàn)為高熱、腦炎和精神神經(jīng)癥狀等[43]。在美國,1964-2008年間人感染 EEEV的病例報告257例,而馬的病例則數(shù)以千計。

7 西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus,WEEV)

1990年,在新疆自治區(qū)烏蘇縣采集的尖音庫蚊中分離到1株病毒(XJ-90260);1991年,在新疆自治區(qū)北部地區(qū)采集的全溝硬蜱中分離到1株病毒(XJ-91006)[40]。病毒分子生物學(xué)研究提示,XJ-90260和 XJ-91006病毒的 NSP4、E1和 3′U TR核苷酸同源性均為100%;3′U TR核苷酸序列具有典型的WEEV特征,與標準WEEV(California株)的同源性達99%[44-45]。血清流行病學(xué)發(fā)現(xiàn),在我國多個省區(qū)人群中均檢測到XJ-90260病毒的抗體,總陽性率為2.71%[45]。

WEEV于1930年首先分離自美國西部病死的馬腦組織,病毒感染引起動物和人的發(fā)熱癥狀和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)美國 CDC統(tǒng)計,從1964-2005年間共報告639例人類感染W(wǎng)EEV的病例,病死率為3%～7%。主要分布于美國和墨西哥,并蔓延至加拿大、巴西等美洲大部分地區(qū)[43]。

8 未分類甲病毒

除上述已鑒定的甲病毒外,我國還報道一些甲病毒分離物,但是尚未得到系統(tǒng)鑒定,見表1。1983-1988年,從海南省采集的蚊和蜱分離出28株病毒[46];1990-1991年,從新疆自治區(qū)采集的蚊和蜱中分離到17株病毒[40];1994年,從山東省煙臺市捕捉的蚊蟲中分離到15株病毒[47],1998年,在海南省不明原因發(fā)熱患者血中分離到2株病毒(HF-7和HC-6)[48]。這些病毒經(jīng)理化和生物學(xué)鑒定符合甲病毒特征,血清學(xué)檢測提示為甲病毒。

9 結(jié) 語

9.1 加強我國甲病毒引起疾病的診斷 目前我國已經(jīng)分離到多種甲病毒,其中包括引起人類發(fā)熱和關(guān)節(jié)痛等癥狀的辛德畢斯病毒、基孔肯亞病毒和羅斯河病毒等,也包括可以引起人或動物如馬腦炎的西方馬腦炎病毒和東方馬腦炎病毒及蓋塔病毒等,但是所有在我國分離到的甲病毒僅有病毒分離(僅有部分文章介紹少量血清流行病學(xué)信息)的報道,均缺乏病毒引起疾病的報道,盡管這些病毒的分離為解釋我國夏秋季節(jié)各地流行的不明原因發(fā)熱和不明原因病毒性腦炎等提供了病原學(xué)線索,但是還不能確定我國存在由這些甲病毒引起的疾病。為此要加強我國甲病毒引起疾病的證實工作。其中最重要的工作是在臨床發(fā)現(xiàn)由甲病毒感染病例的病原學(xué)確定診斷,并對相關(guān)病例采集多種標本開展研究,最主要的是病例組織標本中的病原學(xué)證據(jù),還要采集病例急性期與恢復(fù)期雙份血清開展病毒中和試驗,關(guān)注雙份血清中病毒特異抗體滴度存在4倍及以上的差異。

疾病的診斷是一個系統(tǒng)工程,需要多個單位和部門的密切配合、通力協(xié)作。臨床醫(yī)生要能夠認識甲病毒引起的疾病癥狀,只有早期識別病人才能夠及時采集標本開展試實驗室檢測以確認甲病毒與疾病的關(guān)系。甲病毒感染病人的早期診斷也依賴于研究單位建立特異及實用的甲病毒感染的檢測方法和檢測試劑?？焖?、簡便的診斷方法不僅能夠提高甲病毒感染的實驗室診斷率,而且可以積累充足的臨床和流行病學(xué)資料,為分析甲病毒感染的臨床特征、疾病預(yù)后、流行情況提供基礎(chǔ)資料,并進一步評估其引起的疾病負擔(dān),為我國甲病毒疾病的預(yù)防和控制

提供科學(xué)依據(jù)。

表1 我國近30年新分離甲病毒

9.2 加強我國甲病毒的監(jiān)測 甲病毒主要由蚊蟲傳播也被稱為“蚊傳蟲媒病毒”,近30年來,我國從庫蚊、阿蚊、按蚊、伊蚊標本中分離到多種甲病毒,其中在三帶喙庫蚊分離的甲病毒最多,此外我國還從蝙蝠組織、蜱標本甚至病例標本分離到甲病毒,提示我國可能廣泛存在甲病毒。但是我國分離的甲病毒中除了辛德畢斯病毒和蓋塔病毒外其他病毒僅有1次病毒分離的報導(dǎo),為開展后續(xù)研究帶來了困難。為此必須加強我國甲病毒的監(jiān)測,開展多種媒介生物中甲病毒分離和鑒定工作,特別是對一些僅有1次分離報道的甲病毒進行再分離,進一步積累我國的甲病毒資料。開展我國甲病毒傳播媒介的研究,掌握我國甲病毒的自然循環(huán)規(guī)律為我國甲病毒疾病的預(yù)防和控制提供基本信息。

9.3 加強我國新分離甲病毒的分子生物學(xué)鑒定與研究 我國新分離的甲病毒中還有一部分病毒僅僅依靠ELISA或IFA等血清學(xué)方法的鑒定結(jié)果,由于甲病毒之間存在較嚴重的血清學(xué)交叉反應(yīng),要做到病毒種類的鑒定需要開展交叉中和試驗或進行病毒基因序列的分析等。特別是開展我國分離甲病毒的全基因組序列的測定與分析,以病毒基因組序列分析我國分離病毒與國外分離株的分子進化。這樣既可以從分子水平確定其分類地位,也可以了解我國分離株與國外流行株的分子差異和進化規(guī)律等。

(本工作在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所完成,在此謹向有關(guān)專家致謝。)

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