歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌的分離鑒定*

陳 強,龔 暉,楊金先

遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)隸屬腸桿菌科,愛德華氏菌屬,是導致人獸共患病的一種常見病原菌,其流行區域廣,宿主種類多,對養殖業特別是鰻鱺養殖業產生巨大的影響。1962年Hoshina[1]首次報道該菌與日本鰻(Anguilla japonica)紅病有關。隨后,國內許多學者開始對鰻鱺愛德華氏菌進行了相關的研究。韓先樸等[2]從福建日本鰻體內分離到“福建愛德華氏菌”。王國良等[3]從浙江日本鰻體內分離到“浙江愛德華氏菌”。盧全章等[4]認為引起廣東省日本鰻肝腎病的病原是遲鈍愛德華氏菌和運動性氣單胞菌;董傳甫等[5]發現引起日本鰻敗血腹水病的病原菌除了遲鈍愛德華氏菌,還有溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。余露軍等[6]從患病日本鰻體內分別檢測到遲鈍愛德華氏菌和創傷弧菌(Vibrio vulnificus)。因此,病原菌的鑒定是鰻鱺疾病確診的關鍵。但目前未見對歐洲鰻(Anguilla anguilla)遲鈍愛德華氏菌進行分離鑒定的報道。本試驗采用病原菌分離培養、形態特征觀察、生化特性鑒定、16SrDNA序列分析和屬特異性PCR技術對歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌進行鑒定,以期為歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌的快速確診、人獸共患病的研究和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 API 20E細菌鑒定試劑盒,購自法國生物梅里埃公司;DNTP、TaqDNA聚合酶購自Takara。

1.2 病原菌的分離培養 2008年11月至2009年1月,福建長樂某歐洲鰻養殖場部分養殖池內泡沫增多,病鰻頭腹朝天,行單鰓呼吸。其皮膚和鰭條有明顯的出血點,前胸部腫大,腹壁出現穿孔。腹腔內含渾濁液體,肝臟腫大,形成數個大小不等的化膿病灶。肝區腹腔內壁軟化,內膜穿孔,并有大量的出血點。部分病死鰻肛門紅腫,消化道無肉眼可見的病變。無菌條件下取病鰻的肝組織劃線接種于胰胨大豆瓊脂(TSA)平板,25℃培養24～48h,分離出病原菌。挑取形態特征一致的優勢菌落進行純化培養,觀察細菌生長情況和菌落特征,然后對單菌落進行革蘭氏染色,鏡檢細菌形態。

1.3 病原菌的人工感染試驗 將35尾健康的歐洲鰻(平均體質量 15g),隨機分成 5組,分別置于60cm×50cm×40cm水族箱中。純培養菌按1%的比例接種于營養肉湯,25℃培養24h,活菌計數后用PBS稀釋成一定的濃度,每組按每克體重1×104、1×105、1×106、1×107cfu/m l的濃度腹腔注射歐洲鰻,劑量為0.1m L。對照組注射PBS。試驗期間水溫為17～18℃,充氧,每日換水 50%,及時清除并記錄各組鰻鱺的死亡數量。連續觀察15d,直至無新增死亡為止。用SPSS 13.0軟件采用概率單位法進行半數致死量(LD50)的計算[7]。

1.4 病原菌的生化特性鑒定 取純培養菌,按API 20E細菌鑒定試劑盒的操作步驟進行硝酸鹽還原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明膠酶、V-P反應、吲哚產生、色氨酸脫氨酶、脲酶、H2S產生、檸檬酸利用、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性測定。

1.5 病原菌的16SrDNA鑒定 將純培養菌接種于營養肉湯,25℃培養24h,離心后收集菌體,按煮沸法提取模板DNA。參照文獻[8]設計擴增引物P1和P2(見表1)。引物由上海生工公司合成。PCR擴增按常規方法進行,反應體積 20μl,其中 10×buffer2.0μL,1.5mmol/LMgCl2 1.6μL,10mmol/L 4×DNTP 0.4μL,引物 P1、P2 各 0.2μL,2.5U/μL TaqDNA 聚 合酶 0.2μL,模 板 DNA l.0μL,用ddH2 O補至 20μL。PCR反應程序為:96℃預變性6min,95℃變性1min,55℃復性1min,72℃延伸2min,30個循環后72℃溫育5min。擴增產物送上海生工公司測序。接著采用NCBI的BLAST軟件查詢所測菌株的16SrDNA序列的屬性,將其與從GenBank數據庫中獲得的同屬菌的16S rDNA基因,進行同源性序列比對分析,然后構建菌株系統發育進化樹。

1.6 病原菌的特異性PCR鑒定 參照文獻[9]設計4對擴增引物P3～P10(見表1),對應致病性愛德華氏菌屬的鞭毛蛋白基因簇。PCR擴增方法參照1.5,其中復性退火溫度見表1。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后拍照觀察。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離培養 病原菌生長較緩慢,在TSA培養基上培養24h后菌落為針尖大小,48h后形成圓形光滑、半透明的灰白色小菌落。革蘭氏陰性桿菌,菌體直、單個。將病原菌編號為ET81126。

2.2 病原菌的人工感染試驗 在為期15d的感染試驗中,劑量為1×106cfu/g試驗組在第5d全部死亡;1×105cfu/g試驗組在第8d共死了6尾;1×104cfu/g試驗組從第9d開始出現死亡,到第14d共死了3尾。試驗過程中,大部分魚在死亡前后出現了比較明顯的肝臟型癥狀,與養殖場中發現的病鰻癥狀基本一致。而1×103cfu/g試驗組和對照組的歐洲鰻活動正常,外觀無明顯改變。利用SPSS軟件算得半數致死量(LD50)為4.55×104cfu/g(見表2)。

表1 試驗所用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in this experiment

表2 菌株ET81126對歐洲鰻的致病性試驗Tab.2 The pathogenicity of strain ET81126 to European eel

2.3 病原菌的生化特性鑒定 菌株81126的生化特性鑒定見表3,除了甘露醇、阿拉伯糖陽性外,其它均與陳翠珍[10]對遲鈍愛德華氏菌的描述相同,可初步判斷分離菌為愛德華氏菌。硝酸鹽還原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明膠酶、V-P反應、吲哚產生、色氨酸脫氨酶、脲酶、H2S產生、檸檬酸利用、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性測定。

2.4 病原菌的16SrDNA鑒定 菌株ET81126經PCR擴增所獲得的16SrDNA基因部分序列長度為1508bp。在GenBank中進行16SrDNA基因同源性序列檢索,結果顯示菌株ET81126的序列與愛德華氏菌的同源率為97%～99%。后選擇同源率為99%的5株細菌構建系統發育進化樹,結果顯示菌株ET81126與遲鈍愛德華氏菌(登錄號EF467289)自然聚為1支。綜合生化指標和16SrDNA基因序列分析結果,可將菌株ET81126鑒定為遲鈍愛德華氏菌。

2.5 病原菌的特異性PCR鑒定結果 菌株ET81126經特異性PCR擴增和凝膠電泳,結果顯示:引物 P3/P4和 P9/P10分別出現 848bp和230bp的DNA片段,其它2對引物無擴增條帶(圖1)。進一步證實菌株ET81126為遲鈍愛德華氏菌非典型菌株(E.tarda A typical)。

3 討 論

遲鈍愛德華氏菌可感染日本鰻生長的整個階段,特別是早期(如白仔鰻、黑仔鰻、幼鰻),死亡率更高。其原因可能是日本鰻對遲鈍愛德華氏菌較敏感,但歐洲鰻對該菌的抗性較強,一般只在白仔或黑仔階段發生輕度感染,且常常分離不到致病菌,因此,對歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌病的報道較少。本試驗從患典型“肝臟膿腫”的越冬成鰻中分離到遲鈍愛德華氏菌菌株ET81126,通過人工感染試驗證實菌株ET81126對歐洲鰻具有高度的致病性,半數致死量(LD50)為4.55×104cfu/g,說明該菌對鰻鱺的感染力已逐漸增強,且其宿主的種類也已增加。

表3 菌株ET81126的主要生化指標Tab.3 Main biochemical characteristics of strain ET81126

圖1 菌株ET81126的PCR擴增圖譜Fig.1 PCR finger print of strain ET81126

對于病原菌的鑒定,以傳統細菌學檢測方法中的生化特性鑒定最為常見。但由于生化特性鑒定操作繁瑣、耗時長且至今缺乏水產動物病原細菌專用的鑒定系統,包括培養溫度、孵育時間、生化指標數據庫等。因此,對水產動物病原細菌的生化鑒定仍然是借鑒動物源細菌的鑒定方法。本試驗采用快速診斷魚類細菌性疾病的API 20E生化系統進行鑒定,結果顯示菌株ET81126利用甘露醇和阿拉伯糖,產生 H2S,與陳翠珍[10]報道的結果不一致,無法將其歸為遲鈍愛德華氏菌野生菌型或生物群1。其原因可能是API 20E系統設計的初衷是快速鑒別動物腸道革蘭氏陰性菌,且檢測的生化指標數量有限,造成對水產動物病原細菌的鑒定存在一定的誤差[11]。因此,目前生化特性指標的鑒定結果多作為分子生物學或免疫學等其它鑒定方法的佐證。

隨著分子生物學的發展,16S rDNA測序是目前細菌分類和鑒定的一個有力工具,已廣泛用于多種魚類遲鈍愛德華氏菌的檢測,如日本鰻[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[12]、牙鲆(Para lichthysolivaceus)[13]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[14]、地圖魚(Astronotusocellatus)[15]、斑點叉尾鮰(Icta lurus punctatus)[16]、羅非魚(Tilapia nilotica)[17]。本試驗對歐洲鰻病原菌進行16S rDNA測序,表明分離菌與遲鈍愛德華氏菌自然聚為一支,可確定分離菌為遲鈍愛德華氏菌。因此,16S rDNA鑒定可為歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌感染提供早期、快速、敏感、準確的檢測。但是細菌的16S rDNA序列高度同源,只有少量堿基差異,通過NCBIBLASTN分析得到大量的同源序列,造成結果分析過程冗長復雜。因此,借助細菌種屬特異性引物進行PCR擴增愛德華氏菌屬的鞭毛基因簇,可以快速鑒別愛德華氏菌屬、種及其分型。本研究通過特異性PCR鑒定,進一步確定菌株ET81126為遲鈍愛德華氏菌非典型菌株(E.tarda Atypical)。至于遲鈍愛德華氏菌的PCR分型方法(Typical、A typical)與傳統的分型方法(野生菌群、生物群1)之間的關系目前尚不明了,有待于進一步的研究探討。

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