湖南省日本血吸蟲線粒體atp6基因部分序列的多態性分析*

夏英定,汪世平,李 娟,吳昌義,田 智,尹鐵球,周云飛,張樹菊,馮其梅

2.華南農業大學獸醫學院,廣州 510642

日本血吸蟲病是一種引起嚴重公共衛生問題的人獸共患寄生蟲病,是世界衛生組織確定的六大重點熱帶病之一[1-2],也是我國政府高度重視并重點防治的四大傳染病之一。目前,我國仍有173個縣1 579個鄉(鎮)處于血吸蟲病的流行狀態,估計患者56.60萬[3]。

線粒體DNA(m tDNA)結構簡單、穩定、以母系方式遺傳,核苷酸歧異度大、進化速度快于或等于核DNA[4-5],在種間、種內、群體間和群體內均具有廣泛的多態性。m tDNA序列可以提供有效的分子標記用于種群分類、示蹤個體或相關特殊種群的基因發展歷史,同時還可用于構建種系發育中更細致的分支[6],目前已在寄生蟲的種類鑒定及種系發育研究中得到應用[7-8]。PCR-SSCP是20世紀80年代末發展起來的一種DNA突變檢測技術[9-10],方法靈敏并具備適于大樣本快速篩選等特點,是遺傳變異研究常用方法之一[11]。本研究對采自湖南5個不同地區日本血吸蟲樣本的線粒體atp6基因部分序列進行了PCR-SSCP篩選和遺傳變異的多態性分析,旨在為湖南不同自然隔離群日本血吸蟲的遺傳特性研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源 本研究所用的日本血吸蟲成蟲樣品,分別采自湖南長沙橘子洲、常德澧縣、岳陽樓區與君山區和汨羅磊石5個流行區的野生陽性釘螺,經家兔感染傳代而獲得蟲樣,有關信息見表1。

表1 研究中使用的湖南省日本血吸蟲樣品來源及其atp6序列信息Tab le1 In formation of atp6 sequences of S.japonicum from Hunan Province used in present study

1.2 主要儀器與試劑 DNA提取試劑盒、Ex Taq酶、DL-2000 DNA Marker、rTaq酶,凝膠成像系統,Bio-RAD電泳系統,凝膠圖像分析系統,PCR試劑。

1.3 蟲體材料的處理 從70%酒精保存液中取出單個成蟲(雌雄合抱的成蟲用鑷子輕輕分離為雌、雄兩條)。將雌、雄蟲分裝于新的1.5m L Eppendorf管中,用蒸餾水反復沖洗3次。

1.4 DNA提取、鑒定 按Geneaid公司DNA提取試劑盒(Genomic DNA miniKit protocol-Tissue)說明書操作,抽提DNA樣品用于下一步的擴增。

1.5 atp6部分序列擴增及鑒定 根據GenBankTM上已發表的atp6基因序列設計1對特異引物,上游引 物 (atp6u):5′-TA TCTGGGTTA TGGTTTACTAGA-3′, 下 游 引 物 (atp6d):5′-CGACAGAAAACT TAAGTATCTCT-3′,引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應采用25μL體系:10×緩沖液 2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,MgCl2(25mm ol/L)2.5μL,上 下游 引物 各0.5μL(50pmol/μL),rTaq 0.25μL,gDNA 1μL。反應條件:94℃ 5min;94℃1min,55℃30s,72℃1min,33個循環;72℃5min。經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色后于凝膠成像系統鑒定并拍照。

1.6 SSCP[12]篩選及鑒定 取3μL陽性PCR產物和5μL變性載樣緩沖液混勻,94℃變性10min后,立即置于冰浴中驟冷5min后上樣,6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。12～20℃,90 V電泳約300min。電泳結束后,取下凝膠,雙蒸水漂洗2次;將凝膠放入濃度0.25m g/L EB染色液中染色30min后于凝膠成像系統觀察結果并拍照。

1.7 測序 根據SSCP分析結果,選擇SSCP帶型不同的代表性樣品(篩選時,將特異條帶的相鄰條帶的樣品一并測序,以作比較),共篩選出13個具有代表性的atp6部分基因樣品,PCR擴增后,將PCR產物直接送華大基因科技股份有限公司有限公司測序。

1.8 變異分析 將21份樣品的測序結果用DNAStar 5.0和Mega 4.0軟件進行多態性分析和系統發育研究。

2 結 果

2.1 atp6部分基因SSCP篩選及PCR擴增結果atp6部分基因經SSCP篩選后,通過6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,結果見圖1。

圖1 atp6部分基因SSCP篩選后聚丙烯酰胺凝膠電泳結果Fig.1 SSCP selection resu lts of atp6 by PAGE

從35份樣品中篩選出具有代表性的atp6部分基因13份,以及長沙橘子洲和岳陽樓區樣品8份,對此21份樣品進行了PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,在約500bp處呈現1條特異性條帶(見圖2),與預期的片段大小吻合,且無非特異性條帶,說明本研究設計的PCR引物及反應條件具有較好的特異性。

圖2 atp6部分基因PCR擴增結果Fig.2 PCR resu lts of atp6

2.2 atp6序列測定及其變異與發育分析 將測序獲得的21份樣品atp6部分序列用DNAStar5.0軟件比對(結果見圖3)分析發現,湖南省日本血吸蟲各分離株的483 bp atp6基因序列中有17個變異位點(3.52%),其中16處發生了轉換(G-T轉換有3次、C-T轉換有 7次、A-G轉換有 5次、C-A 轉化1次),其中C-T轉換頻率最高,C-A轉換頻率最低(見表2)。所得的atp6序列中A,G,T,C堿基平均含量分別為20.91%,21.33%,48.24%,9.52%,其中A+T平均含量為69.15%明顯高于C+G平均含量30.85%。遺傳差異分析表明雌雄蟲之間的差異為0.0%～1.3%,各個蟲株間的差異0.0%～1.5%,不同地理來源蟲株間的差異為率0.0%～1.5%(表3)。

表2 atp6部分序列的變異情況Tab le 2 Variation of nucleotideacids sequences of each atp6

表3 各atp6部分序列的差異性比較Table 3 Differences nucleotide sequence among each atp6

種系發育分析表明,湖南省不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因的個體遺傳差異明顯,尤以汨羅和岳陽君山兩地分離蟲株表現突出(圖4)。

3 討 論

日本血吸蟲存在明顯的種和株間變異[13],由于自然環境的隔離,采用傳統的分類方法已無法解釋日本血吸蟲各地域株的遺傳分化的特征。m tDNA作為遺傳標記已廣泛應用于寄生蟲的種類鑒定、遺傳多態性和種群結構及種系發育等研究。Sorensen和Zhao等[14-15]分別通過不同的方法對中國大陸日本血吸蟲蟲線粒體nad 1,nad 4,nad 5,cox3基因進行了遺傳多態性和種系發育以及種群內遺傳變異的分析。Zarow iecki[16]等利用滑行窗口技術分析了血吸蟲線粒體基因組,揭示atp6基因具有最低的變異堿基數和最豐富的信息內容。甚至還有人用線粒體atp6基因和其他線粒體基因作為分子標記來研究胡蘿卜野生品種與和人工培養品種間的遺傳變異情況[17-19]。Gudewar[20]等也報道了關于在印度同一地域里細粒多棘球絳蟲病的兩種不同基因型的線粒體基因atp6和nad2基因特性,并認為以其線粒體atp6和nad2基因分析結果可以指示該基因型的傳播情況。但迄今為止,尚未見不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因遺傳變異研究的報道。

本研究對來自我國湖南省5個不同流行地區的21份日本血吸蟲樣品進行了atp6部分基因序列的遺傳多態性分析。結果表明來自不同流行區的21個樣品總體變異率為3.52%,種內各個蟲株間差異在0.0%～1.5%之間。種系發育分析表明,湖南省不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因的個體遺傳差異十分明顯,尤以汨羅和岳陽君山兩地分離蟲株表現突出,出現這個現象的原因可能與日本血吸蟲線粒體atp6基因進化活躍的遺傳特征有關。同時,或許因為湖區年年不斷的漲水季節造成釘螺的遷移,導致相鄰地域之間蟲株互換頻繁,故發生個體之間遺傳特征的交叉現象。此外,湖南省流行區內長期使用大量化學藥物進行滅螺滅蚴工作,也可能導致該地區日本血吸蟲由于藥物選擇壓力的加大,以致進化速度加快。但是,是否由于生存環境的選擇壓力造成了同一地理來源日本血吸蟲個體之間atp6基因的遺傳差異,其原因尚有待于進一步研究。

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