家蠅抗菌物質誘導表達后的電泳分析＊

許兵紅,曾莉萍,董衛華

許多昆蟲在受到外界誘導時,能迅速產生一些體液免疫因子,如凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白及抗菌肽,這些物質主要是抗菌肽對細菌、某些真菌、病毒、原蟲有特殊殺傷或抑制作用。目前已有多種昆蟲的抗菌基因被誘導表達,研究主要集中在鱗翅目和雙翅目昆蟲[1-5]。我們對絲光綠蠅(L ucilia sericata)[6-7]和家蠅(Musca domestica)[8-9]的抗菌物質進行誘導表達研究后,又對家蠅抗菌物質誘導表達后的電泳分離進行了探討,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 昆蟲及飼養 供試驗用的家蠅由本實驗室室內飼養繁殖,幼蟲生長條件為:溫度26℃、相對濕度75%,光照采用60w白熾燈12h/d,幼蟲飼料各組分比例如下:麥麩600g,魚粉100g,牛奶粉 40g,酵母粉8g,蛋白胨15g,水1 500mL。

1.2 應試菌種 溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)由本實驗室提供,使用前將凍存的菌種復蘇,接種到固體培養基上,37℃恒溫培養16～18h備用。

1.3 誘導 取室內飼養的家蠅3齡幼蟲(幼蟲孵出第3d),用2號昆蟲針針刺體壁誘導,每蟲1針,處理后置于幼蟲飼料罐中飼養。

1.4 血淋巴收集 經針刺誘導處理后第48h,收集存活的幼蟲,用0～4℃冷水反復沖洗,再用無菌雙蒸水沖洗3次,濾紙吸干蟲體表面水分,剪去頭部收集血淋巴于1.5mL離心管中,10 000r/min(6.64×103g,r=5.94cm)離心10min,取上清液備用,或置于-20℃冰箱保存。

1.5 抑菌活力測定 抑菌活力測定采用平板濾紙片法,濾紙片直徑6mm。固體培養基配比如下:蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、瓊脂 20g,加雙蒸水至1 000mL,調p H至7.2,每個直徑7.5cm培養皿加入12mL培養基制成平板備用。細菌復蘇培養后,取培養至對數期細菌配成6×108cells/mL菌液,涂于平板上,將濾紙片加7μL血淋巴樣品,37℃培養24h后測量記錄抑菌環直徑。

1.6 針刺的誘導效果實驗 提取家蠅幼蟲經針刺誘導48h后的血淋巴,觀察記錄其對溶壁微球菌的抑菌效果,以未經誘導正常飼養的家蠅幼蟲的血淋巴為對照,每組重復3次。

1.7 熱處理去雜蛋白效果和去雜蛋白后的抑菌效果實驗 提取家蠅誘導后48h的血淋巴,1.5mL離心管加樣 200μL,分別置于 100℃水浴 10s、30s、1min、3min、5min、和 80℃水浴 30s、1min、3min、5min處理后,加雙蒸水 100μL,混勻后,10 000r/min離心10min去除沉淀,取上清,每組分別取7μL用于平板實驗,觀察不同溫度處理不同時間的去雜蛋白效果和去雜蛋白后對溶壁微球菌的抑菌效果。

1.8 電泳分析 經誘導后 48h的血淋巴,經100℃、80℃水浴熱處理不同時間后,取血淋巴離心上清,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),10%分離膠,3%濃縮膠,樣品加樣20μL,觀察各樣品的電泳行為。

2 結 果

2.1 針刺的誘導效果 家蠅幼蟲經針刺體壁處理后48h,提取的血淋巴對溶壁微球菌有明顯的抑菌活性,3次重復的抑菌環直徑分別為24、23和23 mm,而對照組亦有抑菌環,但環小,僅為12 mm。

2.2 80℃高溫處理后的抑菌效果 見表1。

圖1 80℃處理不同時間后對溶壁微球菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

表1 80℃處理不同時間后對溶壁微球菌的抑菌環直徑(mm)Table 1 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

2.3 100℃高溫處理后的抑菌效果 見表2。

表2 100℃處理不同時間后對溶壁微球菌的抑菌環直徑(mm)Table 2 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

圖2 100℃處理不同時間后對溶壁微球菌的抑菌效果Fig.2 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

2.4 電泳分析 見圖3。

3 討 論

昆蟲抗菌基因的表達產物有溶菌酶、抗菌蛋白和抗菌肽,其中,溶菌酶和抗菌蛋白只起輔助作用,抗菌肽是主要的抗菌物質,對家蠅抗菌物質的誘導雖有較多的報道,但經加熱處理后去除變性蛋白后的抑菌活性以及電泳分析尚未見報道。

圖3 電泳圖譜Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis1:80℃30s;2:1min;3:3min;4:5min;5:100℃5min;6:3min;7:1min;8:30s;9:10s

實驗結果表明,家蠅幼蟲經針刺誘導后,其血淋巴對溶壁微球菌有明顯的抑菌環產生,對照組對溶壁微球菌雖然也有抑菌環產生,但明顯小于誘導組。提示針刺體壁可誘導家蠅幼蟲體內產生抗菌物質。

家蠅幼蟲血淋巴含大量的蛋白成分,需進行預處理去除雜蛋白才易于分離,本實驗采用了熱處理使蛋白變性離心去除的方法。100℃處理血淋巴時,經30s即變性,處理30s～5min等不同的時間后,離心可去掉大量的蛋白沉淀,且隨處理時間延長,離心去掉的變性蛋白增多。100℃水浴30s、1min后,其上清對溶壁微球菌仍有抗菌活性,100℃處理3min和5min后觀察不到明顯的抑菌環,可見100℃處理時抗菌活性喪失較快,可能抗菌肽也隨之變性被離心去掉。80℃水浴30s后血淋巴并沒有蛋白變性發生,水浴1min后開始有蛋白變性發生,離心可去掉變性蛋白,水浴3min和5min后蛋白變性明顯,離心可去掉大量的變性蛋白。且經80℃處理不同時間的上清均有明顯的抑菌活性,隨處理時間的延長,抗菌活性喪失較慢。可見,抗菌肽誘導表達后提取的血淋巴,采用80℃處理30s,離心不能去除其血淋巴中的雜蛋白,雖然其上清抑菌活性強,但電泳時由于血淋巴蛋白太多,分離效果不明顯(圖3中第1電泳道)。采用80℃處理1min左右后離心可去除大量的血淋巴雜蛋白,而且上清的抑菌活性保持較好,電泳分離效果比較清晰(圖3中第2電泳道)。采用80℃處理3min和5min后離心可去除更多的血淋巴雜蛋白,但上清的抑菌活性明顯減弱(表2)。提示純化前血淋巴預處理宜采用80℃水浴1min后離心去掉變性蛋白的方法。經100℃水浴熱處理3min和5min的血淋巴上清與其他7個熱處理樣品在蛋白電泳區帶上也有明顯的差異,100℃處理3min和5min的血淋巴上清對溶壁微球菌無明顯的抑菌環產生,電泳圖譜也比其他處理組少2個明顯的區帶,此2條差異區帶可能為抗菌肽組份。

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