白紋伊蚊基因表達定量PCR內參基因的選擇＊

吳家紅,程金芝,孫 宇,陳 璐

隨著多個物種基因組全序列的揭曉,定量研究基因表達水平在生命科學領域已益顯重要。實時熒光定量RT-PCR技術(real-time quantitative PCR,qPCR),作為一種高效的定量 PCR技術,可以實時監測某個基因在不同細胞、組織、個體以及發育不同階段或者是某種特殊處理條件下的表達水平。因此,當前已廣泛用于基因芯片數據的驗證,RNA干擾后基因表達差異的驗證,以及疾病的診斷等。然而,為了獲得真實可靠的實驗結果,在此過程中通常需要采用內參基因對數據進行校正和標準化,以消除不同樣品在RNA產量、質量以及反轉錄效率上可能存在的差別。理想的內參基因應該是在所有細胞、不同發育階段以及不同處理因素下其表達水平均不受影響。然而穩定表達的基因幾乎是不存在的,因此利用單一看家基因用于標化,可能造成與實際表達水平相差幾十倍以上的差異[1]。為解決這一問題,事先檢測看家基因的穩定性,以及需要幾個看家基因同時作為內參,就需要在實驗設計時考慮周全。

當前,國內尚未見蚊蟲基因表達定量PCR分析內參基因篩選的相關報告。為此,本研究選擇白紋伊蚊β-actin、rspL40、BTF3a、rsp5、rsp27a、superoxide等6個看家基因,對其作為內參基因的效應進行檢測,為后續qPCR最適內參基因的選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 白紋伊蚊廣州株,引自軍事醫學科學院微生物流行病研究所媒介生物學與控制研究室,由本室常規養殖,溫度(25±2)℃,相對濕度(80±5)%,光照14 h/d,羽化后喂食糖水。實驗共分6組:解剖5d齡未吸血雌蚊(SG組)、饑餓12h雌蚊(吸血含前先饑餓12h,JSG組)、飽血雌蚊(吸血2 h,腹部飽脹者;BSG0組)和飽血24h雌蚊(BSG24)的唾液腺。收集去頭、去唾液腺后剩余的雌蚊(C組),羽化后5d齡的去頭雄蚊(有唾液腺,M組),以及去頭雌蚊(含唾液腺,F組),其中F組用于擴增效率分析。-80℃保存備用。

1.2 主要試劑 Trizol試劑購自美國 Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒(PrimeScript TM RT reagent Kit)和熒光定量 PCR試劑盒(SYBRTMPremix Ex TaqTM)購自日本 TaKaRa公司;DNA酶 I試劑盒(Deoxyribonuclease I,Amplification Grade)購自美國Invitrogen公司;其他試劑均為國產分析純產品。熒光定量PCR儀(ABI 7300型)為美國ABI公司產品。

1.3 引物的設計及合成 參考 GenBank中白紋伊蚊相應基因的核苷酸序列,采用ABI公司Prim 3.0軟件設計引物,大連 TaKaRa公司合成,具體見表1。其中rsp5設計了兩對引物。

表1 侯選基因的克隆參數Table 1 Cloning parameters for candidate reference genes

1.4 實時RT-PCR

1.4.1 RNA抽提 將7組樣品分別加入Trizol試劑,按照試劑操作說明進行總 RNA提取。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測所得總RNA的質量和濃度。

1.4.2 DNA去除 按照DNA酶I試劑盒的說明進行。去除DNA后的總RNA直接用于反轉錄。

1.4.2 逆轉錄反應:按照逆轉錄試劑盒的說明操作。反應體系為:總 RNA 500 ng,5×PrimeScript緩沖液2μL,PrimeScript酶混合物0.5μL,寡核苷酸多聚 T引物(Oligo dT)和隨機6堿基引物(Random 6 mers)引物各 0.5μL,加無 RNA酶水(RNase Free dH2O)至總體積為10μL。反應條件:37℃30 min,85℃5 s。-20℃保存備用。每組3個樣品。

1.4.3 擴增效率分析 利用F組cDNA為模板,進行10倍稀釋,共設5個實驗濃度;分別對6個基因進行熒光定量 PCR,構建標準曲線,計算擴增效率和 R2。

1.4.4 PCR片段序列分析 將PCR擴增產物進行亞克隆,送 TaKaRa公司測序,并用DNAstar5.0進行序列分析。

1.4.5 熒光定量 PCR 取上述5ng逆轉錄產物(cDNA)進行PCR,按照熒光定量PCR試劑盒的說明書進行,每個樣品重復3次,每組做3個重復。反應體系為:2×SYBR○RPremix Ex TaqTM 10μL,10 μmol/L上、下游引物各0.8μL,50倍 ROX參考染料(50×ROX Reference Dye)0.4μL,cDNA模板5ng,加無 RNA酶的水(RNase Free dH2O)至 20 μL。反應條件:95℃30 s;95℃5 s,60℃34 s,共40個循環。反應結束后確認real-time PCR反應的擴增曲線和熔解曲線。

1.4.6 數據處理和分析 數據分析采用Microsoft Office Excel 2003和 geNorm程序進行。從 http://medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/網址下載geNorm程序在Excel中將不同樣本中某一內參基因Ct值最小者對應樣品的表達量定義為1,其他樣品此內參基因的相對表達量則為2-ΔCt(ΔCt=各樣本Ct值-最小Ct值)將這些數據導入geNorm程序在進行數據格式轉換后通過Change Data命令利用geNorm程序計算基因表達穩定度M值,對內參基因的表達穩定度進行排序(M值越小則表達越穩定),最后根據內參基因標準化因子的配對差異分析(Vn/n+1)判定內參基因的最適數目。

2 結 果

2.1 內參基因的選擇 根據文獻調研及 GenBank上已知序列信息,本研究篩選6個功能不同的常用看家基因作為侯選基因。利用ABI公司Prim 3.0軟件,設計熒光定量PCR引物對并進行檢測。PCR擴增產物經測序均與目標序列100%一致性,表明6個基因引物設計的特異性好;采用10倍稀釋,構建6個基因的標準曲線,PCR擴增效率和R2值見表1。PCR擴增效率顯示,有5個基因 PCR擴增效率在96%～112%之間,而 rsp27a基因擴增效率在141%;6個基因的R2值均在98%以上,說明標準曲線線性關系很好,因此棄rsp27a基因,余5個基因進行后續實驗。

2.2 內參基因表達的穩定性分析

2.2.1 白紋伊蚊不同組織中內參基因表達穩定性geNorm 軟件分析顯示 ,β-actin、BTF3a、rsp5-1、rsp5-2、superoxide、rspL40 在雌蚊唾液腺、無唾液腺雌蚊組織及雄蚊組織中,表達穩定度M的平均值分別是0.66,0.25,0.58,0.54,0.94,0.25;表達穩定度由高到低依次排序為:rspL40,BTF3a>rsp5-2>rsp5-1>β-actin>superoxide;見圖 1geNorm 軟件以0.15為默認取舍值,即當Vn/n+1<0.15時,說明沒有必要選擇使用數量大于n+1的看家基因作為內參。本研究結果顯示V2/3=0.226,而V3/4=0.146,提示最適內參基因數目為3(圖2)。因此可選用的內參基因有:BTF3a,rspL40,rsp5。

2.2.2 白紋伊蚊唾液腺組織吸血不同時相內參基因表達穩定性分析 geNorm軟件分析顯示,白紋伊蚊唾液腺組織在吸血不同時相,β-actin、BTF3a、rsp5-1、rsp5-2、superoxide、rspL40 表達穩定度 M的平均值分別是 0.46,0.38,0.25,0.24,0.28,0.24;表達穩定度由高到低依次排序為:rspL40,rsp5-2>rsp5-1>superoxide>BTF3a>β-actin(圖 3);說明rspL40和rsp5表達最穩定。geNorm軟件以0.15為默認取舍值,即當Vn/n+1<0.15時,說明沒有必要選擇使用數量大于n+1的看家基因作為內參。本研究中Vn/n+1均<0.15,說明使用一種內參基因,rspL40或rsp5即可(圖4)。

圖4 白紋伊蚊唾液腺組織吸血不同時相內參基因最適數目判定Fig.4 Pair-wise variation analysis between the normalization factors NFn and NFn+1,to determine the optimal number of reference genes for normalization in different blood-feeding phases from Aedes albopictus

3 討 論

近年來,隨著qPCR和基因芯片的廣泛使用,關于在不同物種和不同組織內參基因的選擇已見很多報道[2-3]。當前,與蚊蟲相關的標化基因常見的有:β-actin,核糖體 RNA基因等;本研究根據文獻調研,選擇了6個功能不同的看家基因,對其在白紋伊蚊不同組織及吸血不同時相時唾液腺組織中的表達差異進行了探討。其中rsp5有文獻報道用作半定量PCR的內參基因[4],因此,設計引物時設計了兩對引物,以確認不同引物對對基因表達穩定度的影響。為了確定穩定表達的基因,在樣品的準備時嚴格按照時間點取樣,保證唾液腺解剖時完整;總RNA制備、定量都采用同一方法和同一機器進行。相同量的RNA在同一條件下進行逆轉錄。以盡可能減少逆轉錄及 PCR中的實驗誤差。最后采用geNorm軟件對研究結果進行進一步分析。

geNorm是Vandesompele等[5]于2002年編寫的一款用于微軟Excel平臺的VBA宏程序,主用于侯選看家基因穩定度排序及找出合適看家基因。因該程序免費,可直接從網上下載,因此是目前常用于侯選看家基因篩選常用程序之一。geNorm軟件分析顯示,在白紋伊蚊不同組織中基因表達最穩定的基因是rspL40,BTF3a,其次是 rsp5。然而最適內參基因數目變異度顯示 V2/3=0.226,而V3/4=0.146<0.15,提示單純用一個內參基因作標化,對于標化不同組織中的差異表達并不是適合的,最適內參基因選擇的數目應該是3個,因此可選擇的基因就是rspL40,BTF3a,rsp5。而在吸血不同時相唾液腺組織基因表達最穩定表達基因是rspL40,rsp5;其次是superoxide。最適內參基因數目變異度V2/3=0.075<0.15,提示其最適的內參基因數目是1或者2個。因此,在研究吸血不同時相唾液腺組織基因表達差異時,可選擇rspL40和rsp5作為內參基因。而β-actin基因無論是在不同組織中的差異表達還是吸血不同時相的差異表達均不適于作內參基因。

rsp5基因設計兩對引物,兩對引物擴增的PCR效率及R2值均相差不大,說明引物設計好。而且geNorm軟件分析結果也顯示該兩對引物的 PCR擴增后表達穩定性基本一致。因此,認為同一基因,不同引物對對基因表達穩定性影響不大。此外,本研究結果還顯示不同的處理因素、不同組織基因表達的穩定性是不一致的。因此,在進行標化基因選擇時,應進行仔細的分析和確證。

[1]張艷君,朱志峰,陸融,等.基因表達轉錄分析中內參基因的選擇[J].生物化學與生物物理進展,2007,34(5):546-550.

[2]Hiel MBV,Wielendaele PV,Temmerman L,et al.Identification and validation of housekeeping genes in brains of the desert locust Schistocerca gregaria under different developmental conditions[J].BMC Molec Bio,2009,10:56 doi:10.1186/1471-2199-10-56.

[3]Scharlaken B,de Graarf DC,Goossens K,et al.Reference gene selection for insect expression studies using quantitative real-time PCR:The head of the honeybee,Apis melliferia,after a bacterial challenge[J].Jonline Insect Sci.2008,8:33.Available online:insectscience.org/8.33.

[4]Arca B,Lombardo F,Francischetti IMB,et al.An insight into the sialome of the adult female mosqutitoAedes albopictus[J].Insect Biochem Molec Biol,2007,37:107-127.

[5]Vandesompele J,De Preter K,Pattyn F,et al.Accurate normalizaition of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol,2002,3(7):1-11.