申克孢子絲菌菌絲相和酵母相cDNA消減文庫的構建及差異表達基因的篩選＊

周 汛,楊致邦,肖異珠

申克孢子絲菌為一種雙相型真菌,25℃表現為菌絲相,37℃為酵母相,其酵母相可在感染者體內組織增殖,形成小的芽生孢子而致病。申克孢子絲菌的雙相性表明該菌不同菌相存在差異表達基因,在不同的環境條件下,通過菌體信號轉導的調控,不同的基因表達,形成酵母相或菌絲相。目前申克孢子絲菌雙相轉換的相關研究僅涉及少數幾個基因[1-4],其雙相轉換的分子機制尚未完全明了,研究申克孢子絲菌雙相轉換機制對揭示其發病機理有重要意義。

本研究在應用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術成功構建了高特異性的申克孢子絲菌菌絲相(mycelium,M)和酵母相(yeast,Y)的正反cDNA消減文庫的基礎上,對差異表達基因進行生物信息學分析,以篩選出與雙相轉換相關的差異表達基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 申克孢子絲菌標準株CMCC(F)D1a,購于中國醫學科學院南京皮膚病研究所。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒(Autolab,China);PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech,American);SMART cDNA Amplification Kit(Clontech,American);PCR產物純化試劑盒(Autolab,China);T-載體連接試劑盒(Promega,American);質粒提取試劑盒(Autolab,China);

1.1.3 引物和接頭序列(Clonetech PCR-Select cDNA Subtraction Kit提供)

接頭1:

接頭2R:

1.2 方法

1.2.1 菌絲相和酵母相細胞總RNA的提取 分別取孢子絲菌菌絲相(標記M)和酵母相(標記 Y)菌體約200mg,按植物總RNA提取試劑盒按說明書操作提取總RNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.2.2 cDNA的合成 分別取3μL M和 Y的總RNA為模板,按 SMART PCR cDNA Synthesis試劑盒說明書操作合成cDNA,主要過程為合成M、Y的cDNA第一鏈及第二鏈;去除cDNA短片段;RsaI酶切處理雙鏈cDNA。

1.2.3 抑制性消減雜交 按照PCR-Select cDNA Subt raction Kit說明書操作。分別以RsaⅠ酶切后的M、Y的cDNA為檢測子和驅動子,連接接頭1和和接頭2R,將檢測子與過量的驅動子混合后進行兩次雜交,雜交后的“M+Y”、“Y+M”再行兩輪抑制性PCR擴增;所得的二次 PCR產物利用 PCR purification kit進行純化。

1.2.4 cDNA消減文庫的構建 按照Diatchenko L[5]參考文獻方法操作。

1.2.5 轉化重組子的篩選及單克隆檢測 挑取有插入片段的白色單克隆菌落,接種于含100mg/L Amp的LB培養基中,37℃靜止培養5h;取1μL于96孔PCR反應板內,利用消減雜交試劑盒中提供的巢式引物 PrimerT7和 PrimerSP6進行 PCR擴增,擴增產物電泳觀察插入的差異表達片斷的大小及分布范圍。

1.2.6 “M+Y”、“Y+M”文庫測序 在紫外透射儀上挑取插入片斷大于250bp、帶型單一的陽性克隆,以 T7或SP6為正向引物,用 ABI 9600測序儀進行單向測序,將所測序列,即表達序列標簽(expressed sequence tag,ESTs)進行生物信息學分析。

1.2.7 ESTs數據的生物信息學分析 包括 ESTs數據預處理、EST數據的拼接和聚類分析、Unigene開放性讀碼框的預測、利用 NCBI Nt,NCBI Nr,SwissProt,KEGG,COG,InterPro及 GO數據庫對篩選的差異表達基因進行注釋和功能分類。

2 結 果

2.1 申克孢子絲菌菌絲相和酵母相正反cDNA消減文庫的構建

2.1.1 申克孢子絲菌絲相(M)和酵母相(Y)總RNA的的鑒定 M和 Y RNA樣品經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外燈下觀察,均可見28S、18S、5.8S(5S)3條清晰的rRNA條帶,見圖1。

圖1 菌絲相及酵母相細胞總RN AFig.1 The total RNA isolated from yeast and Mycelium cells M:Mycelium Y:Yeast

2.1.2 申克孢子絲菌絲相(M)和酵母相(Y)cDNA合成:M、Y cDNA合成效果好,cDNA主要分布在0.5～2 kb,平均長度1 kb,呈長瀑布條帶,見圖2,圖3。

2.1.3 cDNA經RsaI酶切效果檢測RsaI酶切前,M、Y樣品cDNA主要分布在0.5～2 kb,平均長度1 kb;酶切后片段明顯減小,平均500bp左右,見圖4。

2.1.4 接頭連接效率檢測 (Marker 1kb plus:10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,0.8kb,0.5kb,0.3kb)PCR結果示條帶彌散,與酶切完cDNA類似,提示接頭已連上,見圖5。

圖4 cDNA及 RsaI酶切電泳圖譜Fig.4 cDNA and cDNA ofRsaI digestedM:Marker 1kb plus;1,3:M,Y cDNA;2,4:M,Y cDNA ofRsaI digested

圖5 接頭連接PCR擴增圖譜Fig.5 Adaptor ligation amplified by PCRM:Marker 1kb plus;1:M+1;2:M+2;3:Y+1;4:Y+2

2.1.5 SSH產物的電泳鑒定 經SSH消減后的cDNA片段較消減前分布區域明顯縮小,兩輪PCR擴增后平均片段長度為500-600bp左右,表明 cDNA得到了良好的均衡和消減,見圖6。

圖6 兩輪PCR電泳圖譜M:Marker 1kb plus;1:Y+M第一輪PCR產物;2:M+Y第一輪PCR產物;3:+M第二輪PCR產物;4:M+Y第二輪PCR產物Fig.6 PCR production after twice subtraction

2.1.6 第二輪PCR產物純化后濃度及純度 純化后的M+Y及 Y+M PCR產物濃度分別為:0.101 μg/μL,0.075μg/μL;OD260/280 分別為:1.78,1.70。提示cDNA純度較高,無蛋白質、核酸及鹽類等污染。

2.1.7 消減文庫單克隆的PCR擴增 隨機挑取白色菌落進行 PCR擴增,鑒定陽性克隆插入片斷大小,插入片斷主要集中于400～1 000bp,見圖7。

2.1.8 “M+Y”、“Y+M”文庫測序及分析 M+Y文庫獲得751條ESTs,其中高質量718條,低質量28條,載體 ESTs5條。ESTs序列長度主要分布在600～1 000bp,平均690.95bp,帶載體序列的 ESTs長度主要分布在600～900bp,平均694.1bp;不帶載體序列的 ESTs長度主要分布在300～500 bp,平均為410.5bp。Y+M文庫獲得875條ESTs,其中高質量809條,低質量55條,載體 ESTs11條。ESTs序列長度主要分布在400～900bp,平均長度為575.9bp,帶載體序列的 ESTs長度主要分布在400～800bp,平均長度為 582.3bp,不帶載體序列的ESTs長度主要分布在300～600bp,平均長度為411.4bp。

圖7 消減文庫部分陽性克隆的PCR擴增結果Fig.7 Some samples amplified by PCRM:marker DL2000 Plus:250bp,500bp,800bp,1kb,2kb,3kb,4.5kb

2.2 ESTs數據的生物信息學分析

2.2.1 ESTs數據預處理結果 M+Y文庫的718條高質量 ESTs經過拼接組裝后,獲得52條序列重疊群(Contigs),49條單一序列(Singlets),共101條非冗余序列簇(Unigenes),占14.06%;Y+M文庫的809條高質量ESTs經過拼接組裝后,獲得109條 Contigs,140 條 Singlets,共 249 條 Unigenes,占30.77%(見表3)。M+Y文庫的101條 Unigenes平均長度為530.39bp,最大的由70個 ESTs組成,有 ORF的 Unigenes63條,占 62.4%,無 ORF的有38條,占37.6%;最長ORF的平均長度為186.19 bp。Y+M文庫的249條 Unigenes平均長度為499.28bp,最大的由 62個 ESTs組成,有 ORF的Unigenes194條 ,占 77.9%,沒有 ORF 的 55 條 ,占22.1%。最長ORF的平均長度為193.59bp。

2.2.2 Unigenes數據庫比對結果 Blastn NCBI Nt:M+Y文庫的101條Unigenes有注解的共93條,占92.1%,其中有多個重復序列,去除重復序列后得到35條同源基因序列;Y+M文庫的249條Unigenes有注解的共232條,占93.21%,去除重復序列后得到91條同源基因序列。Blastx NCBI Nr:M+Y文庫有注解的共47條,占46.5%;Y+M文庫有注解的共 213條,占 85.5%。Blastx SWISSPROT:M+Y文庫有注解的共14條,占13.9%;Y+M文庫有注解的共61條,占24.5%。Blastx KEGG:M+Y文庫有注解的共34條,占33.7%;Y+M文庫有注解的共149條,占59.8%。COG分類:M+Y文庫有注解的共6條,占5.9%,其中,2條為轉錄后修飾,蛋白質轉換和伴侶蛋白;氨基酸運輸和代謝的、能源生產和轉換、一般功能預測及功能未知的各1條;Y+M文庫有注解的共27條,占18.5%,其中,8條為翻譯,核糖體結構和生物起源;6條為能源生產和轉換;轉錄:3條;碳水化合物運輸和代謝:3條;氨基酸運輸和代謝、脂質運輸和代謝、輔酶的運輸和代謝、轉錄后修飾,蛋白質轉換和伴侶蛋白、復制,重組和修復、一般功能預測及細胞骨架各1條;Interpro:M+Y文庫有注解的共10條,占9.9%;Y+M文庫有注解的共 42條,占16.9%。數據庫比對分析結果:M+Y文庫有注解的共9條,占8.9%;Y+M文庫有注解的共32條,占12.9%。

3 討 論

抑制性消減雜交(SSH)技術[6]是一種以抑制性PCR反應為基礎,將標準化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。該技術將待測的cDNA分為檢測子(tester)和驅動子(driver),標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度,消減雜交步驟去除了檢測子和驅動子之間的共同序列,使差異表達序列得到擴增。SSH技術的本質是除去共同的cDNA序列,有效富集差異表達基因的序列,故敏感性較高,在克隆差異表達基因方面得到廣泛使用[7-9]。該方法也應用于部分致病性真菌的致病性和耐藥性的研究當中,如曲霉、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌,白念珠菌等[10-12]。劉紅芳、席麗艷等應用SSH技術構建了馬內菲青霉酵母相和菌絲相的消減cDNA文庫,并進行了差異表達基因的初步篩選[13]。

生物信息學(bioinformatics)[14]是生物學與計算機科學以及應用數學等學科相互交叉而形成的一門新興學科。它通過對生物信息的獲取、加工、存儲、檢索與分析,綜合運用數學、計算機科學和生物學的各種工具,進而達到揭示數據所蘊含的生物學意義的目的。從已建好的cDNA庫中隨機取出一個,從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序,所獲得的一段短的cDNA部分序列,即為表達序列標簽(EST)[15]。EST作為表達基因所在區域的分子標簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質,能穿越家系與種的限制,容易在EST庫中搜尋到新的基因。

本研究是在成功構建申克孢子絲菌標準株酵母相和菌絲相差異表達cDNA文庫的基礎上進行生物信息學分析,對所有數據進行去載、拼接、聚類和Blastn分析及數據整理,M+Y文庫獲得101條Unigenes;Y+M文庫獲得249條Unigenes。這些拼接后得到的Unigenes序列通過與多個數據庫的比對分析,發現M+Y,Y+M兩個消減文庫中都出現有多個重復的基因序列,在兩輪PCR中也出現了幾條特異條帶,這幾個基因都多次重復,從M+Y/Y+M兩者的比對結果來看,這些多次重復基因沒有在 Y+M/M+Y中出現,表明這不是假陽性產生的,而是正常被消減出來的結果,理論上講重復序列的出現可能是樣本間表達差異大,差異豐度高的基因。申克孢子絲菌酵母相菌絲相的轉換伴隨著不同菌相細胞差異基因的高表達,這些高表達的差異基因可分為四類:(1)結構基因類:如18S、25sRNA基因,某些結構基因在申克孢子絲菌酵母相菌絲相狀態下的獨特表達,可能是菌相轉換的結果;(2)代謝酶類:參與碳水化合物、氨基酸、脂質和輔酶運輸和代謝,環境的改變勢將影響細胞代謝的增強或代謝途徑的改變。(3)細胞表面分子類,這些分子參與細胞內的信號轉導,推測其在菌相轉換中起介導細胞基因表達的調控或細胞行為的改變;(4)功能不明的細胞分子。它們在申克孢子絲菌雙相轉換機制中的作用也有待進一步驗證,在已知這些基因全部或部分序列后對其功能及其與菌相轉換的關系進行更深入的研究顯得尤為重要。

另外,我們的試驗結果未能驗證已報道的與申克孢子絲菌雙相轉換相關的基因。如:編碼鈣/鈣調蛋白激酶家族中的 SSCM K1基因sscmk1,其在GENEBAN K的編號是A Y823267.1;編碼胞漿磷脂酶A2的基因 ssg-2,其編號是A Y078408;細胞周期素依賴激酶的編碼基因 PhoSs,其編號是AF116453;PKC的編碼基因 pkcSs-1,其編號是AF12492.1。與M+Y及 Y+M cDNA差異基因文庫中的所有基因序列進行比對,沒有找到相同的基因。分析可能的原因為:1.雖然SSH技術的本質是除去共同的cDNA序列,有效富集差異表達基因的序列,敏感性較高,但對差異豐度不顯著的基因可能不會全部被檢出;2.雖然在篩選出具有插入片段的克隆后進行了大規模的測序,仍然可能漏掉部分差異基因片段;3.對 ESTs進行拼接組裝后得到的unigene的序列可能不是完全準確。所以,成功構建申克孢子絲菌標準株酵母相和菌絲相差異表達cDNA文庫及差異表達基因的生物信息學分析只是為進一步篩選與申克孢子絲菌雙相轉換相關基因奠定了基礎,還需要針對篩選出的有意義的差異表達基因進行下游驗證試驗。

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