耐多藥結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性與 gyr基因突變的初步研究＊

趙麗麗,夏 強,2,趙秀芹,劉志廣,萬康林

耐藥結核病尤其耐多藥結核病(至少對異煙肼和利福平耐藥)已成為嚴重的公共衛生問題[1]。我國的耐藥結核病流行情況也較為嚴重,耐多藥率為8.32%[2],對于MDR-TB病,目前通常采用二線抗結核藥物進行治療。由于喹諾酮類藥物的不良反應小,價格低廉等優點,已被 WHO納入耐MDR-TB病的臨床治療方案,成為聯合治療MDR-TB的核心藥物之一。然而在我國,喹諾酮類藥物投入臨床時間較長、應用的抗菌范圍較廣,致使耐藥形勢日趨嚴重,因此,深入MDR-TB對喹諾酮類藥物的耐藥情況非常重要。

喹諾酮類藥物主要作用于DNA促旋酶,該酶屬于Ⅱ型拓撲異構酶,是由兩個A亞基(GyrA)和兩個B亞基(GyrB)組成的四聚體,A亞基由gyrA基因編碼,可以切斷、再結合和超螺旋化DNA鏈;B亞基由gyrB基因編碼,含ATP水解功能區,能促進ATP水解,為A亞基解旋提供能量,DNA促旋酶能在原核細胞DNA復制過程中暫時切斷DNA雙鏈,引入負超螺旋結構,使DNA能夠有效復制、轉錄和重組[3];但喹諾酮類藥物能與DNA促旋酶作用形成藥物-DNA-酶復合物從而抑制DNA促旋酶的活性,阻礙DNA復制,導致細菌死亡。以往的資料表明:gyr基因突變是導致結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要原因,其中,這些突變位點主要集中于喹諾酮耐藥決定區(QRDR),即A亞基的第74-113位氨基酸,B亞基的第495-533位氨基酸[4]。本研究通過DNA直接測序對125株MDRTB臨床分離株gyr基因喹諾酮類藥物耐藥決定區的突變情況進行分析,探討MDR-TB對喹諾酮類藥物耐藥產生與gyr基因突變的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本試驗所涉及的125株MDR-TB臨床分離菌株由中國疾病預防控制中心傳染病所結核室提供,其中福建77株(2005年31株,2007年23株,2009年23株),河南14株(2005年),四川19株(2006年),西藏15株(2006年)。參照菌株采用標準菌株 H37Rv(ATCC 27294),購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2 藥敏試驗所用氧氟沙星(Ofloxacin)為Sigma產品,使用時按照廠家提供的純度和效價計算用量,氧氟沙星在培養基的終濃度為2μg/mL[5]。藥敏試驗所用培養基的配方、制備,操作步驟和結果判斷等均參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]。

1.3 DNA制備 采用CTAB法[7],置-20℃保存備用。

1.4 PCR擴增

1.4.1 擴增gyrA基因耐藥決定區:所用上游引物為:5’-TCGACTATGCGATGA GCGTG-3’,下游引物為 5’CGATGCGTAAACCGACCC-3’,擴增片段長度為860bp,涵蓋編碼gyrA的喹諾酮耐藥決定區(第74-113位氨基酸)。PCR反應體系總體積為 20μL,其中,2 ×Taq PCR MasterMix 10μL(TIANGEN),DNA 模板 1μL(50 ng),Forward Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mmol/L)1μL,無菌雙蒸水7μL;陰性對照反應體系中不加DNA模板,無菌雙蒸水8μL,其他不變。反應條件:95℃5 min;95℃30 s,58.5℃30 s,72℃40 s,30次循環;72℃3min。

1.4.2 擴增gyrB基因耐藥決定區 所用上游引物為 5’-CCGCTGTGATCTCGGTGAAG-3’,下游引物為5’AGACCCTTGTACCGCTGAATG-3’,擴增片段長度為780bp,涵蓋編碼gyrB的喹諾酮耐藥決定區(第495-533位氨基酸),PCR反應體系總體積為 20μL,其中 ,2 ×Taq PCR MasterMix 10μL(TIAN GEN),DNA 模板 1μL(50 ng),Forward Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mM)1μL,無菌雙蒸水 7μL;陰性對照反應體系中不加DNA模板,無菌雙蒸水8μL,其他不變。反應條件:95℃5 min;95℃30 s,57℃30 s,72℃40 s,30次循環;72℃3min。

1.5 序列測定 PCR產物送北京擎科生物技術有限公司測序。

1.6 分析方法 使用MegAlign軟件對基因測序結果進行分析。

2 結 果

2.1 藥敏試驗 結果判斷參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》,根據耐藥百分比判別[6]:耐藥百分比=(含藥培養基的菌落數/對照培養基的菌落數)×100%,若耐藥百分比>1%為耐藥(R),≤1%為敏感(S)。經藥敏試驗鑒定,125株MDR-TB中有50株對喹諾酮藥物耐藥,其余75株為敏感,質控菌株H37Rv藥敏結果為敏感。

2.2gyrA和gyrBPCR檢測 將125株MDRTB及H37Rv的gyrA和gyrB的QRDR分別進行PCR擴增,結果均為陽性,擴增片段長度分別為860bp 和 780bp,如圖 1,圖 2。

圖1 PCR得到 gyrA的QRDRsM:DNA標準;1-6:菌株編號;7:陰性對照;8:H37RvFig.1 PCR product ofgyrAQRDRsM:DNA marker;1-6:the clinical isolates;7:negative control;8:H37Rv

2.3 基因測序分析

圖2 PCR得到 gyrB的 QRDR1-6:菌株編號;7:陰性對照;8:H37Rv;M:DNA標準Fig.2 PCR product ofgyrBQRDR1-6:the clinical isolates;7:negative control;8:H37Rv;M:DNA marker

表1 耐喹諾酮MDR-TB臨床分離株 gyrA基因突變特點Table 1 The characteristics ofgyrAgene mutations of quinolone resistant MDR-TB clinical isolates

2.3.1gyrA基因突變分析 H37Rv的gyrA基因未見突變。125株MDR-TB臨床分離株的第95位點均由AGC→ACC。75株喹諾酮敏感菌株未見其他位點突變,50株喹諾酮耐藥菌株有39株發生其他位點的突變:主要分布在90,91和94位點,其中有兩株發生雙位點突變,具體突變類型及突變率(突變的耐藥菌株數/耐藥菌株數)見表1。

2.3.2gyrB基因突變分析 H37Rv的gyrB基因未見突變,125株MDR-TB臨床分離株中有5株發生突變,突變菌株均為喹諾酮耐藥菌株,其中,4株伴隨gyrA突變,具體突變類型及突變情況見表2。

表2 耐喹諾酮MDR-TB臨床分離株 gyrb基因突變特點Table 2 The characteristics ofgyrBgene mutations of quinolone resistant MDR-TB clinical isolates

3 討 論

喹諾酮類藥物作為一類重要的抗結核藥物,已被廣泛用于MDR-TB的治療,但我們的研究發現:125株MDR-TB中有50株對喹諾酮類藥物耐藥,耐藥率高達40%,提示MDR-TB中,喹諾酮類藥物的耐藥情況比較嚴重,這可能與臨床上長期、廣泛和不規則地使用喹諾酮類藥物有關。因此,建議在MDR-TB的治療中,不能盲目使用喹諾酮類藥物,應先進行該類藥物的藥敏檢測并結合藥敏試驗結果指導用藥。

MTB對喹諾酮類藥物的耐藥通常與gyr基因突變、藥物外排泵或細胞壁的通透性有關,其中以gyr基因突變為主[8]。我們的結果也證實了這一點:在50株氯氟沙酮的 MDR-TB中,有40株gyr基因發生突變,其中39株gyrA基因發生突變,突變率為78%(39/50),與以往的文獻報道接近[9-10],5株gyrB基因發生突變,但有4株伴隨gyrA基因突變。

gyrA基因突變株中,以94位點較為常見,占gyrA基因突變的61.5%(24/39),其中有2株合并90或91位點的突變。gyrB基因突變主要位于500,506,534和539位點,但絕大多數都伴隨gyrA基因突變。

此外,125株MDR-TB的gyrA基因95位點均由AGC突變為ACC,也進一步支持 SHI等[11-12]的觀點:gyrA基因95位點突變與基因的遺傳多態性有關,而與對喹諾酮類藥物的耐藥關系不大。

由此可見,MDR-TB對喹諾酮類藥物的耐藥主要與gyr基因突變有關,其中gyrA基因突變是gyr基因突變的主要形式,且特異性較高,可以考慮通過檢測gyrA基因快速預測菌株對喹諾酮類藥物的耐藥表型;gyrB基因也會發生突變,但絕大多數都伴隨gyrA基因突變,很少發生單獨gyrB基因基因突變的情況。

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