HLA-G在結(jié)腸癌外周血中的表達(dá)及其臨床意義

徐亦君， 竺明晨

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國惡性腫瘤中位居第五，嚴(yán)重危害人類健康。組織相容性白細(xì)胞抗原G(HLA-G)為非經(jīng)典的HLA I類分子，是一種重要的免疫耐受分子，能抑制NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解以及T細(xì)胞增殖反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)HLA-G在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)[2]，其在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)被認(rèn)為可能是腫瘤細(xì)胞得以逃避宿主免疫監(jiān)視的手段之一[3-4]。HLA-G除了在結(jié)腸癌組織中表達(dá)外，在人類外周血單個(gè)核細(xì)胞中也有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究HLA-G在結(jié)腸癌患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，初步探討其在結(jié)腸癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集南京市第一醫(yī)院2010年11月至2011年5月外周血標(biāo)本共189例。189例中結(jié)腸癌患者85例，其中男43例，女42例，年齡48～74歲，平均年齡62歲；經(jīng)結(jié)直腸鏡及病理確診的結(jié)腸良性病48例(包括結(jié)腸息肉20例，潰瘍性結(jié)腸炎28例)，其中男26例，女22例，年齡43～78歲，平均61歲；另56名為健康體檢者作為正常對照，其中男35名，女21名，年齡56～79歲，平均58歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PBMC的分離和總mRNA的提取 抽取2 mL外周血，EDTA-K2抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。Trizol裂解并提取PBMC細(xì)胞總mRNA，通過甲醛瓊脂糖變性電泳和紫外分光光度計(jì)分析RNA的質(zhì)量和濃度。

1.2.2 第一鏈cDNA的合成 EP管中加入5×Reaction Mix 4 μL, Maxima Enzyme Mix 2 μL , RNA 2 μg，加入Nuclease-Free水至20 μL。PCR擴(kuò)增儀(Thermo)上25℃10 min，50℃15 min，85℃5 min。儲(chǔ)存第一鏈cDNA于4℃冰箱或立即PCR。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物并比對其特異性。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。HLA-G引物如下：上游5′-CTGGTTGTCCTTGCAGCTGTAG-3′;下游5′-CCTTTTCAATCTGAGCTCTTCTTTCT-3′。內(nèi)參基因β-actin引物如下：上游5′- GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′；下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。應(yīng)用LightCycler1.5 (Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系20 μL包括：第一鏈cDNA 2 μL, 2×SYBR Green Mix 10 μL (Takara) ,10umol/L上下游引物各0.8 μL，去離子水6.4 μL。反應(yīng)條件為95℃ 30 s、95℃15 s、58℃15 s、72℃45 s收集熒光，40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。

1.2.4 相對表達(dá)率(ratio) 將HLA-G、β-actin cDNA按5個(gè)梯度分別擴(kuò)增，每個(gè)梯度分別擴(kuò)增3個(gè)復(fù)孔并計(jì)算均值。采用內(nèi)參基因(β-actin)來標(biāo)準(zhǔn)化HLA-G mRNA表達(dá)，HLA-G ratio=2-△△CT，△CT= CTactin-CTHLA-G，△△CT=△CTactin-△CTHLA-G。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相對表達(dá)率以中位數(shù)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增效率

HLA-G和β-actin模板稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，HLA-G和β-actin mRNA的擴(kuò)增效率分別為1.98和1.93，CT值和cDNA模板量對數(shù)值之間的相關(guān)性系數(shù)R2均為0.998。目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近，且CT值和cDNA模板量之間呈密切相關(guān)(見圖1)。

圖1 CT值和cDNA模板量對數(shù)值之間的相關(guān)性

2.2 相對表達(dá)率

正常對照PBMC HLA-G mRNA中位數(shù)的95%可信區(qū)間(CI)為[0.66, 1.41]，結(jié)腸癌患者HLA-G mRNA CI為[1.15, 2.68]，結(jié)腸良性病患者HLA-G mRNA CI為[0.56, 1.51]。結(jié)腸癌組的HLA-G mRNA相對表達(dá)率高于正常對照組(P=0.03)和結(jié)腸良性病變組(P=0.02)，結(jié)腸良性病變組和正常對照組中HLA-G mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.66)，見圖2。

圖2 HLA-G mRNA 在正常對照組、結(jié)腸良性病變組和結(jié)腸癌組PBMC中的表達(dá)

3 討論

HLA-G位于人第6號染色體短臂上，屬于人類一種非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體的Ⅰ類分子，目前已廣泛被認(rèn)為是一種免疫耐受分子，選擇性高表達(dá)于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，可通過多種途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生母胎免疫耐受，保護(hù)胎兒正常發(fā)育，是維持正常妊娠的重要因子。HLA-G作為一種免疫耐受分子，除了在習(xí)慣性流產(chǎn)和移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用較多外，研究還發(fā)現(xiàn)HLA-G在結(jié)腸癌[2]、黑色素瘤[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等多種腫瘤組織中高表達(dá)。HLA-G介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃避的方式主要靠抑制NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等細(xì)胞免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，以及抑制Th1和增強(qiáng)Th2細(xì)胞因子的分泌來實(shí)現(xiàn)的[8]。相關(guān)研究已證實(shí)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞表面HLA-G的表達(dá)及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，但是結(jié)腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HLA-G的表達(dá)情況不是很清楚。

本研究通過采集結(jié)腸癌患者靜脈血并提取單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測HLA-G在結(jié)腸癌患者PBMC中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：HLA-G在結(jié)腸癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)高于健康人群(P=0.03)和結(jié)腸良性病變患者(P=0.02)。此結(jié)果同結(jié)腸癌組織中HLA-G的表達(dá)情況一致。LeBouteiller等[9]發(fā)現(xiàn)外周血中可溶性HLA-G 可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞結(jié)合，阻止T 細(xì)胞與經(jīng)典HLA-Ⅰ類抗原結(jié)合，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞第一活化信號的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺傷作用。我們推測外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G所起的作用可能也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷，但具體機(jī)制是否同可溶性HLA-G的作用相似，尚有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

手術(shù)切除是目前治愈結(jié)腸癌的有效方法，診治越早患者的生存率就越高。但多數(shù)患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，雖然接受了如化療、放療等輔助治療，但仍避免不了復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等導(dǎo)致治療失敗。因此，尋找可靠有效的結(jié)腸癌腫瘤生物標(biāo)志物是當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌患者的PBMC HLA-G mRNA表達(dá)較健康人和結(jié)腸良性病變者升高，所采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有方便采集和無創(chuàng)性等特點(diǎn)，方法簡單可靠，成本低廉，可成為一個(gè)新的結(jié)腸癌分子標(biāo)志。

綜上所述，HLA-G在結(jié)腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)升高，與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)對結(jié)腸癌的早期診斷和評估預(yù)后具有重要意義。

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