FAP家系的臨床特征和基因突變分析

仲 堅(jiān)， 周建農(nóng)， 張曉梅， 周 欣， 關(guān) 心， 朱 明， 張?jiān)f， 馬國(guó)建， 陳森清

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一種常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為大腸內(nèi)布滿了腺瘤(幾百個(gè)至幾千個(gè))，如果不治療，幾乎所有的患者將發(fā)展成大腸癌。FAP的全球發(fā)病率為出生嬰兒的1/10 000～1/7 000。1986年Herrera等發(fā)現(xiàn)此病的發(fā)生與5號(hào)染色體的畸形密切相關(guān)；1987年確定了與FAP相關(guān)的基因位于染色體5號(hào)上；1991年分離出結(jié)腸腺瘤性息肉病(adenomatus polyposis coli, APC)基因，其為一種腫瘤抑制基因，確切地位于5q21-22上[1]，含有15個(gè)外顯子，外顯子15 占整個(gè)基因編碼區(qū)的75%以上，是胚系突變和體細(xì)胞突變最普遍的靶子。迄今已報(bào)道了800多種APC基因的病理性改變，其中95%為無(wú)意突變或移碼突變，且多集中在15外顯子的5′端，突變產(chǎn)生功能異常的截短蛋白[2]。

為了提高現(xiàn)有突變篩查體系的篩查通量和檢出率，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、PCR-變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatograph, DHPLC)、DNA 序列分析等系統(tǒng)篩查的方法研究一個(gè)FAP家系成員的APC基因全部的外顯子，分析其APC基因胚系和體細(xì)胞突變情況，探討APC基因突變類型與FAP臨床特征之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1. 1 對(duì)象

1.1.1 家系 本研究包括家系成員三代7人，已確診為FAP的是其二代成員Ⅱ1和Ⅱ2。經(jīng)患者及其家族成員的同意，我們調(diào)查了家系，見(jiàn)圖1。

圖1 家族性腺瘤性息肉病患者家系圖

1.1.2 患者臨床資料 家系先證者Ⅱ1患者，38歲，直腸癌伴雙卵巢轉(zhuǎn)移及肝腎隱窩種植轉(zhuǎn)移，結(jié)腸鏡示：全大腸多發(fā)廣基息肉，直徑0.5～1.0 cm大小不等，距肛門(mén)8 cm直腸潰瘍型腫瘤，結(jié)合家族史診斷為直腸癌、FAP，經(jīng)4療程CAPEOX(卡培他濱+奧沙利鉑)方案化療，療效達(dá)部分緩解后行姑息性直腸癌前切除術(shù)、雙附件切除及肝腎隱窩轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)。患者(Ⅱ1)的弟弟(Ⅱ2)，36歲，大腸及胃多發(fā)息肉2年，全大腸彌漫息肉，呈地毯樣，行預(yù)防性全大腸切除+回腸肛管J-Pouch吻合術(shù)，術(shù)后病理為全大腸多發(fā)絨毛管狀腺瘤，部分腺上皮低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。家族史調(diào)查顯示：患者的父親(Ⅰ2) 40歲時(shí)死于直腸癌。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 收集先證者(Ⅱ1)癌變組織、腺瘤性息肉、大腸黏膜標(biāo)本及其患病弟弟(Ⅱ2)的腺瘤性息肉、大腸黏膜標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)，同時(shí)收集家族各成員外周血標(biāo)本，提取外周血及組織的DNA。

1. 2 方法

1.2.1 MLPA檢測(cè)APC基因的大片段缺失 采用APC基因檢測(cè)試劑盒MLPA2P043 (MRC-Holland, Netherland)，內(nèi)含有20個(gè)APC外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域、11個(gè)對(duì)照的探針混合體，可以對(duì)APC全基因進(jìn)行檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)程序依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)節(jié)。100 ng模板DNA在98℃變性5 min，60℃與探針液雜交過(guò)夜，在熱穩(wěn)定性酶Ligase265作用下，54℃與相同序列雜交的長(zhǎng)、短探針間連接15 min，連接的探針再經(jīng)通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度呈9～2 bp增加，可在ABI 3100Avant測(cè)序儀(Applied Biosystmes, CA)上經(jīng)毛細(xì)電泳分離，用GeneScan 3.1軟件(AppliedBiosystmes, CA)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出目的片段的拷貝數(shù)，以判斷分析。

1.2.2 PCR擴(kuò)增APC基因 參照文獻(xiàn)[2]和用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)34對(duì)引物，引物序列見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]，分別擴(kuò)增APC基因的全部15個(gè)外顯子，其中前14對(duì)引物分別擴(kuò)增第1～14外顯子，后20對(duì)引物用以擴(kuò)增最大的外顯子15，每個(gè)擴(kuò)增片段大小為200～500 bp。PCR反應(yīng)體系：25 μL，內(nèi)含50～100 ng基因組DNA，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各0.5 μmol /L，Taq DNA聚合酶2 U。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3 變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)分析(WAVE system, Transgenomic)各段擴(kuò)增產(chǎn)物單次進(jìn)樣量5～8 μL，柱溫55℃～62℃，流動(dòng)相為0.1 mol/L N-三乙基乙酰胺(TEAA，分析純)和不同濃度的乙晴，流速0.9 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

1.2.4 DNA序列分析 DHPLC分析中出現(xiàn)特定異常峰形的PCR產(chǎn)物，由北京六合華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 MLPA 檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 外周血DNA胚系突變篩查 在所有家系成員的外周血DNA的APC基因MLPA檢測(cè)中，均未檢出APC基因的大片段缺失，提示在這一家系中不存在胚系來(lái)源的大片斷缺失突變型式。

2.1.2 組織DNA體細(xì)胞突變篩查 我們對(duì)提取自先證者(Ⅱ1)癌變組織，腺瘤性息肉、大腸黏膜標(biāo)本及其患病弟弟(Ⅱ2)的腺瘤性息肉、大腸黏膜標(biāo)本的DNA進(jìn)行了APC基因大片段缺失分析，結(jié)果僅在家系先證者(Ⅱ1)癌變息肉標(biāo)本DNA的MLPA圖譜中，發(fā)現(xiàn)APC基因啟動(dòng)子區(qū)域的單拷貝缺失，提示在癌變組織存在等位基因丟失型體細(xì)胞突變。

圖2 MLPA檢測(cè)APC基因大片段缺失的峰型圖

2.2 DHPLC檢測(cè)APC基因的突變和DNA測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 外周血DNA胚系突變篩查 DHPLC洗脫圖中，與正常對(duì)照單峰相比，先證者(Ⅱ1)和其受累弟弟(Ⅱ2)的15外顯子第7對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一提前洗脫的異常峰，洗脫圖譜呈現(xiàn)雙峰，提示有胚系突變存在(見(jiàn)圖3)，相同的異常峰型見(jiàn)于先證者受累弟弟的兒子Ⅲ3)，家系其他具有血緣關(guān)系的成員的峰形與正常對(duì)照相同。經(jīng)反向測(cè)序證實(shí)，單一洗脫峰的樣本為純合子(見(jiàn)圖4A)，而出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰的樣本該位點(diǎn)為雜合子(見(jiàn)圖4B)。序列分析結(jié)果顯示在互補(bǔ)鏈上存在CTTTT 5個(gè)堿基的缺失，此點(diǎn)對(duì)應(yīng)編碼序列的3925-3929的AAAAG堿基缺失即c.3925_3929 del AAAAG。

2.2.2 組織DNA體細(xì)胞突變篩查 先證者(Ⅱ1)和其受累弟弟(Ⅱ2)各組織DNA的 DHPLC洗脫圖中，除同樣出現(xiàn)c.3925_3929 del AAAAG的胚系突變外，未見(jiàn)其他異常，提示除通過(guò)MLPA方法檢出的先證者(Ⅱ1)癌變息肉APC基因啟動(dòng)子區(qū)域的等位基因丟失型突變外，未見(jiàn)其他形式體細(xì)胞突變。

圖3 APC基因第15外顯子第7對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)域的變性高效液相色譜圖譜實(shí)線示先證者(Ⅱ1)異常峰形，虛線示非受累的家族成員(Ⅱ3)及正常對(duì)照峰形。

圖4 正常(A)與異常峰型(B)的反向測(cè)序圖譜，箭頭表示在互補(bǔ)鏈此點(diǎn)對(duì)應(yīng)編碼序列的3925-3929的AAAAG堿基缺失即c.3925_3929 del AAAAG。

3 討論

對(duì)APC基因突變的研究國(guó)外報(bào)道很多，但在我國(guó)人群中研究的還不多。盡管一方面受基因突變分析方法和技術(shù)限制，另一方面存在有非APC基因突變致病的FAP患者，使得APC基因突變的篩查不能作為替代結(jié)腸鏡篩查的標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)基因診斷費(fèi)用、技術(shù)要求高，不能像結(jié)腸鏡一樣在臨床廣泛開(kāi)展，但由于APC基因突變的外顯率可達(dá)100%，因此目前較為一致的觀點(diǎn)是：家系成員APC基因診斷工作有助于篩查家族高危人群，指導(dǎo)低幼齡APC基因突變攜帶者的臨床診治，如果在一個(gè)家族中篩查出引起疾病的胚系突變，則可清楚地區(qū)分?jǐn)y帶者和非攜帶者，前者需要進(jìn)行定期的內(nèi)窺鏡監(jiān)測(cè)，而后者則不需要這樣做。同時(shí)，F(xiàn)AP發(fā)病和癌變年齡可在育齡之后，因此APC基因診斷工作對(duì)優(yōu)生優(yōu)育尤其具有重大意義。

APC基因的第15外顯子是目前已知的人類基因組中最大的外顯子，通常采用蛋白截短試驗(yàn)(protein truncation test, PTT) 進(jìn)行初篩，方法及過(guò)程均較為繁瑣。而我們通過(guò)20對(duì)引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)第15外顯子的直接DHPLC檢測(cè)。通過(guò)DHPLC及測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了此家系3名成員均攜帶APC基因c.3925_3929 del AAAAG位點(diǎn)的胚系突變，導(dǎo)致在1309位密碼子處發(fā)生移碼突變，這一突變?cè)斐闪薃PC基因終止密碼子的形成，從而形成有功能障礙的截短蛋白。

最近的研究表明，約15%的典型FAP是由APC大片段缺失引起的，用傳統(tǒng)的突變檢測(cè)方法難以檢測(cè)出來(lái)[4]，因此我們應(yīng)用MLPA方法檢測(cè)APC基因的大片段缺失。MLPA可在一次反應(yīng)體系中快速、敏感、高效地檢測(cè)出多達(dá)40個(gè)目的片段的相對(duì)拷貝數(shù)。在本篩查體系中，在所有家系成員的外周血DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中，均未檢出APC基因的大片段缺失，提示在這一家系中不存在胚系來(lái)源的大片斷缺失突變形式。在體細(xì)胞突變的篩查中，家系先證者(Ⅱ1)癌變組織DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中，出現(xiàn)發(fā)生于APC基因啟動(dòng)子區(qū)域等位基因丟失造成的體細(xì)胞突變，而在其本人和患病弟弟(Ⅱ2)腺瘤性息肉組織DNA則未見(jiàn)此體細(xì)胞突變。

APC基因作為Wnt通路的重要分子，參與了細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)增殖等重要生理工程過(guò)程，從正常黏膜-腺瘤-癌的轉(zhuǎn)化模式上，研究發(fā)現(xiàn)APC基因的表達(dá)產(chǎn)物有下降趨勢(shì)，APC基因兩個(gè)等位基因的失活可以促進(jìn)癌變[5]。對(duì)于FAP患者而言，通過(guò)一個(gè)遺傳性的胚系突變APC基因的滅活，使正常基因的表達(dá)下降到某一閾值之下，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，息肉的發(fā)生或可與之關(guān)聯(lián)，而且這種失控可發(fā)生于雜合子狀態(tài)，如本例中受累弟弟(Ⅱ2)。而等位基因的兩次滅活，或稱為二次打擊可以促進(jìn)并放大這種增殖效應(yīng)，使增殖的細(xì)胞進(jìn)一步向惡性轉(zhuǎn)化，基因突變和等位基因丟失正是基因失活的兩種主要方式，如本例中先證者(Ⅱ1)。由此我們認(rèn)為本例中基因型與其臨床表型存在相關(guān)性：在相近的廣發(fā)性腺瘤息肉發(fā)生年齡段，兩者的臨床癥狀出現(xiàn)差異，具有雙等位基因變異失活的先證者大腸出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腺癌，僅攜帶胚系突變的弟弟尚處于大腸絨毛管狀腺瘤階段。

密碼子第1286～1513號(hào)之間的10%左右的編碼區(qū)集中了約65%的突變，被稱為突變密集區(qū)(mutation cluster region, MCR)[6-7]。1309位于突變的中心區(qū)，有研究指出攜帶c.3925_3929 del AAAAG 位點(diǎn)的胚系突變患者出現(xiàn)胃腸道癥狀和死于結(jié)直腸癌的時(shí)間比一般患者早10年[8]，本次研究中也發(fā)現(xiàn)攜帶此突變的受累成員發(fā)病年齡均低于40歲。

總之，盡管大多數(shù)研究指出APC基因的突變位點(diǎn)與腸道息肉或腸外腫瘤的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性[9]，但也有一些報(bào)道認(rèn)為APC基因突變性質(zhì)與臨床預(yù)防和治療的關(guān)系還不確切[10]，但值得肯定的是胚系突變分析對(duì)預(yù)測(cè)FAP個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)有重要意義，對(duì)家系成員Ⅲ3，建議采取密切的監(jiān)測(cè)措施以降低其患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。而在本研究家系中發(fā)現(xiàn)的APC基因的體細(xì)胞突變類型與FAP臨床特征的關(guān)系，還需要積累更多的病例分析來(lái)確定。

志謝：衷心感謝參與此項(xiàng)研究的患者及家族成員！

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