Ki67、VEGF、nm23在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義

謝春華， 楊基鵬， 劉 崢， 任大宏

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率出現(xiàn)明顯上升趨勢，尤其在國內(nèi)一些大中城市，已躍居女性惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅婦女身心健康[1]。目前研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖及凋亡的異常有關(guān)，是一個多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，包括抑癌基因失活與癌基因的激活[2]。Ki67是一種與增殖細(xì)胞周期相關(guān)的核抗原，能夠識別存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)的核蛋白，反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，是目前腫瘤研究中的熱點。本研究采用組織芯片技術(shù)與免疫組化方法，檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中Ki67、VEGF與nm23的表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床病理資料，分析他們之間的相關(guān)性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例選自我院2006年1月至2010年12月間收治的120例原發(fā)性乳腺癌，均為女性，年齡31～82歲，中位年齡50.2歲。術(shù)前患者均未接受化療、放療以及內(nèi)分泌等治療。按照1997年UICC(國際抗癌聯(lián)盟)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期93例，Ⅲ～Ⅳ期27例。其中有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 主要試劑 Ki67、VEGF、nm23鼠抗人單克隆抗體濃縮液，免疫組織化學(xué)PV9000通用型二步法檢測試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，均購自北京中杉生物技術(shù)公司。抗體工作濃度1∶20。

1.3 檢測方法 所有組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后制作4×10點陣組織芯片，切片厚4 μm，帖附于涂有APES處理過的載玻片上，60℃烤片2 h。免疫組化按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，以已知陽性組織切片為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀 不同生物學(xué)指標(biāo)在細(xì)胞中的著色部位不同。Ki67以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，VEGF與nm23以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。顯微鏡下各取5個高倍鏡視野，各記數(shù)100個細(xì)胞，結(jié)果按陽性細(xì)胞所占細(xì)胞比例的平均值定義為陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性；陽性細(xì)胞數(shù)在10%～25%為弱陽性(+)；陽性細(xì)胞數(shù)在26%～50%為陽性(++)；陽性細(xì)胞數(shù)>50%為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki67、VEGF、nm23在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)(見表1) 120例乳腺癌組織中有89例Ki67呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為74.2%。而在癌旁正常乳腺組織中未見Ki67陽性表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGF在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率分別為78.3%、10.8%，與Ki67的表達(dá)趨勢相似。而nm23在乳腺癌與癌旁正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率分別為4.2%和77.5%，趨勢與Ki67、VEGF相反，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中Ki67、VEGF、nm23的表達(dá)

2.2 乳腺癌組織中Ki67、VEGF與nm23表達(dá)的相關(guān)性(見表2) 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，Ki67表達(dá)與VEGF、nm23無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 乳腺癌組織中Ki67與VEGF、nm23表達(dá)的相關(guān)性

2.3 Ki67、VEGF、nm23表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素間的關(guān)系(見表3、4) 乳腺癌組織中Ki67表達(dá)與患者臨床分期顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無顯著相關(guān)(P>0.05)。VEGF表達(dá)與患者臨床分期及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)也顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小也無相關(guān)性(P>0.05)。nm23的表達(dá)與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小以及臨床分期無相關(guān)性(P>0.05)。并且，Ki67與VEGF的共同表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小及臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)。

表3 Ki67、VEGF、nm23表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

注： * 表示P<0.05

表4 Ki67、VEGF共同表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，與細(xì)胞增殖或分化異常有關(guān)，某些分子標(biāo)志物的表達(dá)與否和表達(dá)高低能夠反映腫瘤細(xì)胞分化的程度。增殖細(xì)胞核抗原(Ki67) 是一種能識別存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)的核蛋白，能夠有效評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)記物，是目前判斷腫瘤侵襲力和腫瘤預(yù)后的最可靠的指標(biāo)[3-5]。

研究表明Ki67與腫瘤細(xì)胞的周期性變化密切相關(guān)，其參與了腫瘤細(xì)胞異常增生、惡變，使細(xì)胞間同質(zhì)性粘附力降低、浸潤力增強，促進(jìn)新生血管生長等整個病理過程。其功能和細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)，在G1晚期/S早期呈微量表達(dá)，S期聚集，尤其在后半期表達(dá)率明顯增高，有絲分裂后期迅速降解或失去抗原決定簇，脫離細(xì)胞周期后迅速降解，半衰期短，因此其表達(dá)水平的高低可以反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)，對評價腫瘤的生物學(xué)行為、判斷其危害性具有重要意義[6]。已有的研究表明在多種惡性實體腫瘤中Ki67的表達(dá)率遠(yuǎn)高于正常組織，其表達(dá)與惡性腫瘤的分化程度及浸潤轉(zhuǎn)移等有關(guān)[7-8]。

本研究顯示，Ki67在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為74.2%，與Bhatavdekar等[9]的報道結(jié)果相似。同時，Ki67陽性表達(dá)與乳腺癌臨床分期呈正相關(guān)，即臨床分期越晚，Ki67陽性表達(dá)越高，進(jìn)一步表明Ki67是反映乳腺癌生物學(xué)行為的可靠指標(biāo)，可以作為判斷腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)及評價乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。有關(guān)Ki67表達(dá)與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系是目前研究的熱點之一，本研究結(jié)果卻顯示Ki67表達(dá)與患者腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無顯著相關(guān)(P>0.05)，與李寶江等[10]的研究結(jié)果一致，尚有待于大樣本的進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果還顯示，Ki67表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小亦無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

VEGF是一種特異性促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的由多種亞型組成的多家族蛋白質(zhì)，在正常組織中常常低水平表達(dá)，而在實體惡性腫瘤中則高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為78.3%，顯著高于癌旁正常乳腺組織。并且有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的VEGF陽性表達(dá)率明顯高于腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者(P<0.05)，表明VEGF表達(dá)與乳腺癌的浸潤及轉(zhuǎn)移之間存在密切聯(lián)系，其可能是VEGF能夠促進(jìn)淋巴管生成，而新生的淋巴管壁較薄，使癌細(xì)胞容易透過管壁進(jìn)入淋巴循環(huán)，從而造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果還顯示，Ki67與VEGF起協(xié)同作用，兩者共表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小及臨床分期呈正相關(guān)性，這與Nakopoulou等[11]的研究結(jié)果一致。可能是癌細(xì)胞在惡性增殖過程中有較多新生血管發(fā)生，而VEGF是血管生成的主要調(diào)控因子，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，加快細(xì)胞的有絲分裂，從而促進(jìn)腫瘤的生長。

nm23是從轉(zhuǎn)移潛力不同的鼠黑色素瘤中分離出來的一種被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的基因，編碼的蛋白產(chǎn)物為核苷二磷酸激酶(NDPK)，是一種能催化多種反應(yīng)具有復(fù)雜生物學(xué)功能的酶，主要通過影響微管裝配、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)及細(xì)胞粘附而維持細(xì)胞的正常分裂狀態(tài)，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究顯示nm23在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，而在正常乳腺組織中呈高表達(dá)，淋巴轉(zhuǎn)移與nm23表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，此與文獻(xiàn)報道基本一致[12-13]。

綜而述之，Ki67的陽性表達(dá)作為衡量乳腺癌細(xì)胞增殖狀態(tài)及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)已經(jīng)得到驗證，而聯(lián)合檢測VEGF、nm23的表達(dá)情況，對于指導(dǎo)乳腺癌臨床分期及確定臨床治療方案具有重要意義。應(yīng)用組織芯片技術(shù)，結(jié)合免疫組化方法，可以高質(zhì)量地檢測乳腺癌組織中多項生物學(xué)指標(biāo)，為乳腺癌的臨床病理評估提供幫助，更有助于正確分析乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素，為判斷預(yù)后和個體化治療提供理論依據(jù)。

[1] Gigerenzer G, Mata J, Frank R. Public knowledge of benefits of breast and prostate cancer screening in Europe[J]. J Natl Cancer Inst, 2009, 101(17):1216-1220.

[2] Hodgson SV, Morrison PJ, Irving M. Breast cancer genetics:unsolved questions and open perspectives in an expanding clinical practice[J].Am J Med Genet C Semin Med Genet, 2004, 129C(1): 56-64.

[3] Oratz R, Paul D, Cohn A, et al. Impact of Oncotype DXTM on decision making in breast cancer clinical practice[J].Breast Cancer Res Treat, 2006, 100: S100.

[4] Papantoniou VJ, Souvatzoglou MA, Valotassiou VJ, et al. Relationship of cell proliferation (ki67) to 99mTc-(v) DMSA up take in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2004, 6 (2): 56-62.

[5] Tan PH, Bay BH, Yip G, et al. Immunohistochemical detection of Ki67 in breast cancer correlates with transcriptional regulation of genes related to apoptosis and cell death[J]. Mod Pathol, 2005, 18 (3) : 374-381.

[6] Lyman GH, Cosler LE, Kuderer NM, et al. Impact of a 21-gene RT-PCR assay on treatment decisions in early-stage breast cancer: an economic analysis based on prognostic and predictive validation studies[J]. Cancer, 2007, 109(6): 1011-1018.

[7] Liu M, Lawson G, Delos M, et al. Predictive value of the fraction of cancer cells immunolabeled for proliferating cell nuclear antigen or Ki67 in biopsies of head and neck carcinomas to identify lymph node metastasis: comparison with clinical and radiologic examinations[J]. Head Neck, 2003, 25(4) :280-288.

[8] 陳燕昌,林舜國,鄭宇輝,等. 乳腺癌Ki-67抗原和DNA倍體的相關(guān)性及臨床意義[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2005, 39(1) : 48-50.

[9] Bhatavdekar JM, Patel DD, Shah NG, et al. Prognostic significance of immunohistochemically localized biomarkers in stage Ⅱ and stage Ⅲ breast cancer: a multivariate analysis[J].Ann Surg Oncol, 2000, 7(4):305-311.

[10] 李寶江，朱志華，王軍業(yè)，等. Ki67、P53、VEGF和C-erbB-2在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究及其臨床意義[J].癌癥，2004，23(10)：1176-1179.

[11] Nakopoulou L，Stefanaki K，Panayotopoulou E，et al. Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-2/Flk-1 in breast carcinomas：correlation with proliferation[J]. Hum Pathol，2002,33(9)：863-870.

[12] 熊曉平，陳修己，杜麗英.乳腺癌nm23基因和雌孕激素受體的表達(dá)與組織學(xué)分級及預(yù)后關(guān)系的研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,47(1):34-36.

[13] 王玉杰，郭文斌，姜清華．乳腺癌腋淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移灶與nm23基因表達(dá)的研究[J]．中國普通外科雜志，2003, 12(5)：351-353.