響應面法優化超聲-微波協同萃取藍藻中葉綠素a工藝研究

尹 騰, 陶文沂＊, 繆恒鋒, 史強

(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學 環境與土木工程學院,江蘇 無錫 214122)

響應面法優化超聲-微波協同萃取藍藻中葉綠素a工藝研究

尹 騰1, 陶文沂＊1, 繆恒鋒2, 史強1

(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學 環境與土木工程學院,江蘇 無錫 214122)

為了探索藍藻葉綠素a的最佳萃取工藝參數,在單因素試驗基礎上,選取乙醇體積分數、萃取時間以及液固體積質量比為自變量,葉綠素a萃取得率為響應值,采用中心組合設計的方法,研究各自變量及其交互作用對響應值葉綠素a萃取率的影響。利用響應面分析方法,模擬得到了2次多項式回歸方程的預測模型,并確定葉綠素a萃取工藝的最佳參數:乙醇體積分數86%、時間133 s、液固體積質量比16∶1(m L∶g),在開啟超聲波、微波功率250 w、萃取兩次的條件下,葉綠素a萃取率達到(2.686±0.013)mg/g。

藍藻;葉綠素a;超聲-微波協同萃取;響應面法

藍藻(Cyanobacteria)俗稱藍細菌(Blue algae)、藍綠藻(blue-green algae),是最簡單、最原始的一類革蘭氏陰性原核生物,能進行光合作用,富含有數種類胡蘿卜素、葉黃素以及葉綠素a(Chla),但無葉綠素b。太湖中藍藻主要由微囊藻(M icrocystis)組成,其中,銅綠微囊藻(Microcystis.aeruginosa)約占90%,是太湖水源有毒害二次污染的主要物種,還有少量水華微囊藻(Microcystis.f lo-saquae)以及螺旋魚腥藻(Anabeana spirodes)等[1]。葉綠素是綠色植物或者藻類進行光合作用的主要色素[2],其分子中的卟啉環結構與人體血紅素結構類似,具有活化細胞、抗貧血、抗菌消炎、抗衰老以及護肝等功效,因此可廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等領域[3]。

葉綠素的提取主要以蠶沙、桑葉等為原料,采用有機溶劑提取法[4]、超聲輔助萃取法[5-6]、微波輔助萃取法[7]、超臨界CO2萃取法[8-9]等。有機溶劑提取法存在溶劑消耗量大,提取時間長、提取率低等缺點;超臨界CO2萃取法對于脂溶性物質提取較好而對葉綠素提取效果不理想[10-11]。微波萃取技術具有設備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現性好、節省時間、節省試劑、污染小、重現性好等特點[12],再加上超聲波的次級效應如機械振動、乳化、擴散、擊碎法、化學效應等也能加速細胞內有效成分的擴散釋放并使其充分與溶劑混合,可以提高萃取效率[13]。本實驗采用超聲-微波波萃取技術(Ultrasonic-Microwave Coordinative Extraction,UMCE),通過響應面設計研究相關因素對葉綠素a萃取率的影響,旨在資源化利用太湖中有嚴重毒害作用的物種藍藻,建立超聲-微波協同萃取葉綠素a技術提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍藻:取自太湖無錫段德林海公司脫水后的新鮮藍藻;甲醇、二甲亞砜、無水乙醇、體積分數95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、鹽酸等均為分析純。

CW-2000型超聲-微波協同萃取儀:上海新托微波溶樣測試技術有限公司產品;高效粉粹機:上海淀久中藥機械制造有限公司產品;TGL-20M高速冷凍離心機:上海盧湘儀離心機有限公司產品;752型紫外可見光光度計:上海光譜儀器有限公司產品;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素a超聲-微波協同萃取工藝 將收集的藍藻曬干,粉碎過60目篩。準確稱取1.00 g干藍藻粉及量取一定量的萃取劑裝于萃取瓶中,設定萃取時間、功率、溫度及開啟超聲系統和水循環進行萃取。

1.2.2 葉綠素a萃取率的測定 萃取完成后,將萃取液離心取上清液用95%乙醇定容,752型分光光度計于波長665 nm和750 nm處測吸光值,然后加入幾滴1 mol/L鹽酸酸化,于波長665 nm和750 nm處再次測吸光值,按下式計算葉綠素a含量[14]:

式中:Ca乙醇為乙醇法測定的葉綠素a質量分數(μg/g);A665、A750分別為乙醇萃取液于波長665 nm和750 nm的吸光值;A665、A750分別為乙醇萃取液酸化后于波長665 nm和750 nm的吸光值;V乙醇為乙醇萃取液的體積(m L);m藍藻為干藍藻粉的質量(g)。

1.2.3 單因素試驗 以60目干藍藻粉為試驗材料,分別以萃取溶劑及乙醇體積分數、萃取時間、微波功率、液固體積質量比和萃取次數做單因素試驗,重復3次。

1.2.4 響應面法優化實驗 在單因素實驗的基礎上,以乙醇體積分數、萃取時間和液固體積質量比因素作為考察對象,以葉綠素萃取率為響應值,采用Design Expert 7.0.0統計分析軟件的響應面法安排實驗,以獲取最優化工藝參數。

2 結果與討論

2.1 超聲-微波協同萃取葉綠素a單因素試驗

2.1.1 萃取劑對葉綠素a萃取率的影響 準確稱取1.00 g干藍藻粉若干份,分別加入甲醇、二甲亞砜、無水乙醇、體積分數95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚20 mL,開啟超聲系統,設定微波功率200 w,萃取時間120 s,萃取1次,考察不同萃取劑對葉綠素a萃取率的影響,結果見圖1。

萃取溶劑,選擇的重要依據在于將目標成分盡可能地萃取出來,依據葉綠素a萃取得率以及溶劑有無毒性來確定最合適的萃取溶劑。由圖1可看出,選擇不同極性的溶劑進行萃取時,溶劑極性越大葉綠素a的萃取得率越大。葉綠素a雖然是脂溶性物質但帶有兩個極性基團,因此具有一定極性,易溶于極性大的溶劑。而且微波具有選擇性加熱,介電常數越小的極性溶劑越容易被加熱,能更好地吸收微波,提高溶劑的活性,另外超聲波的次級效應也能加速細胞內有效成分的擴散釋放并使其充分與溶劑混合,便于萃取。從圖1中可以看出甲醇和體積分數95%乙醇對葉綠素a的萃取得率相差不大,由于乙醇無毒性,因此選擇乙醇為最佳萃取溶劑。

圖1 萃取溶劑對葉綠素a萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of Chl-a

2.1.2 乙醇體積分數對葉綠素a萃取率的影響準確稱取1.00 g干藍藻粉若干份,分別加入不同體積分數的乙醇水溶液20 m L,開啟超聲系統,設定微波功率200 w,萃取時間120 s,萃取1次,考察乙醇濃度對葉綠素a萃取率的影響,結果見圖2。

由圖2可看出,隨著乙醇體積分數的增加,葉綠素萃取率逐漸升高,當達到90%時,葉綠素a萃取得率達到最大;再增加乙醇體積分數,葉綠素a萃取得率開始下降。這是由于在乙醇中加入少量的水時增加了溶劑的極性,有利于微波加熱提高溶劑活性,從而提高萃取得率;當乙醇中含水量增大時,雖然溶劑活性提高了但是脂溶性葉綠素a在水中的溶解性較差,從而導致萃取率下降。故選擇體積分數90%的乙醇為最佳萃取溶劑。

圖2 乙醇體積分數對葉綠素a萃取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of Chl-a

2.1.3 萃取時間對葉綠素a萃取率的影響 準確稱取1.00 g干藍藻粉若干份,分別加入體積分數90%乙醇水溶液15 m L,開啟超聲系統,設定微波功率200 w,萃取1次,考察不同時間對葉綠素a萃取率的影響,結果見圖3。

圖3 萃取時間對葉綠素a萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of Chl-a

從圖3可以看出,隨著超聲-微波時間的增加,葉綠素a的萃取得率逐漸升高,當達到150 s時,葉綠素a萃取得率達到最大,再延長萃取時間葉綠素a有所下降,萃取時間過長葉綠素a熱降解或衍生化可能是導致萃取率下降的原因。

2.1.4 萃取功率對葉綠素a萃取率的影響 準確稱取1.00 g干藍藻粉若干份,分別加入體積分數90%乙醇水溶液15 m L,開啟超聲系統,設定萃取時間150 s,萃取1次,考察不同功率對葉綠素a萃取率的影響,結果見圖4。

圖4 微波功率對葉綠素a萃取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction yield of Chl-a

由圖4可知,微波功率對葉綠素a的萃取率影響不顯著,隨著微波功率的增加,由于超聲波次級作用,加速細胞內有效成分的擴散釋放并使其充分與溶劑混合,葉綠素a的萃取率有一定提高,但提高幅度不明顯,再加上微波作用使物質均勻受熱,兩者的協同作用使得單獨改變微波功率時,對葉綠素a的萃取影響不明顯;當功率達到250 W時,葉綠素a的萃取率達到最大,再增大功率葉綠素a的萃取率反而下降,這與過高的微波功率可能破壞葉綠素a的結構有關,從而使得萃取物中葉綠素a的含量降低,因此選擇微波功率在250 W左右較好。

2.1.5 液固體積質量比對葉綠素a萃取率的影響準確稱取1.00 g干藍藻粉若干份,分別加入不同體積分數90%乙醇水溶液,開啟超聲系統,設定微波功率250 W,萃取時間150 s,萃取1次,考察不同液固體積質量比對葉綠素a萃取率的影響,結果見圖

5。

圖5 液固體積質量比對葉綠素a萃取率的影響Fig.5 Effect of volume of liquid to solid mass ratio on extraction yield of Chl-a

由圖5可知,隨著液固體積質量比增加葉綠素a質量分數也逐漸增大,當液固體積質量比達到15∶1以后,葉綠素a的萃取得率變化不大。這是由于溶劑中葉綠素a濃度很低,溶劑量越大,與物料及溶劑邊界層的葉綠素a濃度差也越大,擴散推動力增大,所以萃取率增大,當溶劑量增加到一定量后,葉綠素a萃取率的增幅會很快降到一個很小的值,從經濟上考慮,溶劑比增大,會增加原料成本及后續濃縮工藝的成本,所以選擇液固比在15左右較好。

2.1.6 萃取次數對葉綠素a萃取率的影響 由圖6可以看出,葉綠素a的萃取得率隨萃取次數增加增大,當萃取2次后,葉綠素a的萃取率隨萃取次數的增加變化不大,因此萃取次數可以根據液固比的大小選擇萃取1～2次。

2.2 葉綠素a萃取工藝響應面法優化

2.2.1 因素的選取以及試驗方案 根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理,結合單因素試驗結果,固定功率250 w,開設超聲系統,萃取1次,選取乙醇體積分數、萃取時間、液固體積質量比三個因素(分別以X1、X2與X3表示),每個因素的低、中、高水平分別以-1、0、1進行編碼,采用三因素三水平的響應面分析方法求取優化的工藝參數,試驗因素與水平設計見表1;以葉綠素a得率為響應值(Y)進行實驗優化,實驗方案及結果見表2。

圖6 萃取次數對葉綠素a萃取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on extraction yield of Chl-a

2.2.2 響應面分析結果 表2為不同條件下所測的葉綠素a的得率,利用Design-expert 7.0.0軟件對表2中所測得的數據進行多元回歸擬合,由表3回歸分析結果表明該模型回歸顯著。各因素經回歸擬合后,得到葉綠素a萃取率對乙醇體積分數、溫度和液固體積質量比(編碼值)的二次多項回歸方程為:

從方差分析可以看出,模型P值小于0.000 1,表明該模型是高度顯著的。同時模型中的參數A、B、AC、A2、B2、C2都是顯著的(P值小于 0.05)。模型失擬項(Lack of Fit)表示模型預測值與實際值不擬合的概率[15]。表 3中模型失擬項的P值為0.596 7,表示有59.67%的概率使得模型偏差由噪音產生,因此模型失擬項不顯著。同時,模型的相關系數R2為0.989 0大于0.9,模型相關度非常好。所以,可以使用該模型來分析響應值的變化。

表1 響應面分析因素與水平Tab.1 Variables and levels in response surface design

為了進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點,通過繪制響應面曲線圖來進行可視化的分析。圖7中分別顯示了3組以葉綠素a得率為響應值的趨勢圖,每組圖中均有2個變量,第3個變量設定在優化水平上。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。圖7a和7b中的等高線呈橢圓形,表明兩者交互作用顯著;圖7c中等高線接近圓形,表明兩者交互作用不顯著。進一步對實驗模型進行典型性分析,以獲得最大葉綠素-a得率時的各萃取條件。通過對二次多項回歸方程X1X2X3分別求偏導,建立方程組得到X1=-0.38,X2=0.22,X3=0.09,即在乙醇濃度為86.20%,萃取時間為133.32 s,液固比為15.92∶1時,可以取得葉綠素a萃取得率理論最大值2.436 m g/g。

表2 響應面分析方案及試驗結果Tab.2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

表3 葉綠素a得率的響應面的方差分析Tab.3 ANOVA of RSM for Chl-a yield

圖7 各變量兩兩相互作用對葉綠素a得率影響的響應面趨勢圖Fig.7 3D surface and con tour plots showing the effect of different variables on Chl-a yield

2.2.3 回歸模型的實驗驗證 為了便于操作,將響應面優化的萃取條件取整為:乙醇濃度86%,萃取時間為133 s,液固比為16:1,萃取1次,采用優化后的實驗條件對回歸模型所得出的葉綠素-a萃取得率進行實驗驗證,經3次重復實驗,所得葉綠素a得率為(2.392±0.09)mg/g,該實驗結果與模型預測結果沒有顯著性差異,在95%置信區間內。在最佳單因素條件下萃取2次所得葉綠素a得率為(2.521±0.065)mg/g,而在采用優化后的實驗條件下萃取 2次,所得葉綠素 a得率為(2.686±0.013)mg/g,也有明顯提高。

2.3 超聲-微波協同萃取與有機溶劑萃取、超聲輔助萃取、微波輔助萃取和超臨界CO2萃取工藝比較

現有工業化葉綠素的提取主要采用有機溶劑萃取法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法、超臨界CO2萃取法等,比較超聲-微波協同萃取法與這些方法的優缺點見表4。

表4結果表明:超聲-微波協同萃取葉綠素a萃取率最高,萃取時間最短,從而可以縮短萃取周期,降低成本;溶劑萃取法萃取時間較長,能耗大,并且選擇的溶劑大多都對人體傷害較大,因此也不宜采用;超臨界CO2萃取法是一種零污染最理想的萃取方式,但其只對于極性較弱的脂溶性物質萃取較好,而對極性較強的葉綠素a,其萃取率將大大降低,并且萃取時間相對較長,導致能耗和成本增加;超聲輔助萃取主要是超聲波可以加速細胞內有效成分的擴散釋放并使物料與溶劑充分混合,但由于超聲功率較低,萃取速率下降,所以在有限時間內葉綠素a萃取得率相對較低;微波輔助萃取葉綠素a時,能在短時間內使局部溶液溫度升高,從而使得整個溶液體系受熱不均勻,形成熱對流,導致溶液與物料接觸受到阻礙,而且在高溫區葉綠素a會有一定降解;超聲-微波協同萃取時,超聲起到攪拌和翻騰的作用,使溶液受熱均勻以及使整個體系充分混合,再加上微波的高能作用,從而使得萃取率要高于超聲和微波輔助萃取。經過對幾種萃取工藝的比較,超聲-微波協同萃取葉綠素a是一種較理想的萃取方式。

表4 幾種萃取工藝比Tab.4 Comparison of several extraction methods

3 結 語

在單因素試驗基礎上,選取顯著性因素乙醇體積分數、時間和液固體積質量比為變量,葉綠素a萃取率為響應值,進行響應面設計,試驗結果表明:超聲-微波萃取葉綠素a的最佳工藝參數:乙醇體積分數為86%、萃取時間133 s、液固體積質量比16,在超聲開微波功率為250 w,萃取2次時,葉綠素a萃取得率為(2.686±0.013)mg/g。

不同萃取方式的對比試驗結果表明,超聲波-微波協同萃取葉綠素a效果最好,與傳統萃取方法相比,除了速度快、能耗小等優點外,還有利于極性和熱不穩定性組分的萃取,避免長時間高溫高壓條件下萃取時,導致葉綠素a的分解,而且它克服了常規超聲波和微波萃取之不足,實現了低溫常壓條件下,對固體樣品進行快速、高效、可靠的預處理。

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Optimization of Ultrasonic-Microwave Coordinative Extraction of Chlorophyll a from Blue Algae by Response Surface Methodology

YIN Teng1, TAO Wen-yi＊1, MIAO Heng-feng2, SH IQiang1
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Environment and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122 China)

On the basis of the results of single factor experiments,the ethanol concentration,extraction time and the ratio of liquid volume to solid mass were selected as independent variables to optimize the extraction process parameters for chlorophyll-a from blue algae.by using central composite design and response surface analysis.the optimum conditions were achieved and listed as follow s:86%ethanol,extraction time 133 s and volume of liquid to solid mass ratio 16∶1(m L/g),microwave power 250 w.Under the optimum conditions,the extraction yield of chlorophyll-a achieved at(2.686±0.013)mg/g.

blue algae,chlorophylla,ultrasonic-microwave extraction,response surface methodology

＊

陶文沂(1946-),男,江蘇無錫人,工學博士,教授,博士研究生導師,主要從事生物發酵工程研究。Email:w ytao1946@163.com

TS 202.3

A

1673-1689(2011)03-0427-08

2010-05-02

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2009BAC52B03);中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(JUSRP20906)。