酸菜中降膽固醇功能植物乳桿菌的體外篩選

于志會, 李常營, 張雪, 李盛鈺, 李達, 楊貞耐＊1,

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長春 130033;3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 132011)

酸菜中降膽固醇功能植物乳桿菌的體外篩選

于志會1,3, 李常營2, 張雪2, 李盛鈺2, 李達2, 楊貞耐＊1,2

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長春 130033;3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 132011)

以分離自東北家庭自制酸菜中的9株植物乳桿菌為研究對象,采用鄰苯二甲醛法篩選具有降膽固醇功能的乳桿菌,并通過耐酸、耐膽鹽及抗生素敏感性實驗,分析菌株的益生特性。結(jié)果表明,多株植物乳桿菌具有良好的降膽固醇功能,其中菌株S56的脫除膽固醇的量最高,達到22.40μg/m L。實驗菌株均能耐受p H 3.0的酸度和10 g/L的牛膽鹽。其中菌株S2-6、S2-5、S4-1和S56在p H 2.0的環(huán)境中能保持生長1 h,具有較強的耐酸性。

植物乳桿菌;膽固醇降解;體外篩選

血清膽固醇水平偏高是誘發(fā)動脈硬化、冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病的主要危險因素,嚴重威脅著人類的健康。20世紀(jì)70年代,科學(xué)家先后通過對大量飲用酸乳等發(fā)酵乳制品的非洲Masai人血清膽固醇的研究和對常飲酸乳的美國人的調(diào)查均發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用[1]。這些結(jié)果引起了國內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注。近年來人們對嗜酸乳桿菌降膽固醇功能進行了大量的研究工作。Danieloson等報導(dǎo)了由豬腸道中分離出的嗜酸乳桿菌LA 16能降低豬血清膽固醇和低密度脂蛋白[2]。Corzo和 Gilliland等研究表明嗜酸乳桿菌能分泌膽鹽水解酶促進甘氨酸和牛磺酸水解,形成的游離膽酸和膽酸鹽進而與膽固醇發(fā)生共沉淀作用[3];另外一些研究發(fā)現(xiàn)其它乳桿菌如發(fā)酵乳桿菌[4]、加氏乳桿菌[5]、雙歧桿菌[6]和干酪乳桿菌[7]等也具有良好的體外降膽固醇功能。但目前關(guān)于植物乳桿菌降膽固醇的研究報道甚少[8]。

一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品是功能性益生菌的重要來源。為了篩選具有降低膽固醇功能的益生性乳桿菌,本研究利用體外篩選方法分析了9株分離自東北家庭自制酸菜的植物乳桿菌(L.p lantarum)的降膽固醇作用,并對其耐酸、耐膽鹽、抗生素敏感性等益生特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株分離自東北家庭自制酸菜,為作者所在實驗室保藏菌株。經(jīng)表型、生理生化、API試驗和16srDNA鑒定均為植物乳桿菌。陽性對照的益生菌株為Lactobacillus rham nosusGG(LGG),分離自市售LGG發(fā)酵乳(伊利乳業(yè)集團)。菌株在含體積分數(shù)30%甘油的MRS培養(yǎng)基中,-80℃凍存。使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基,37℃活化2次。

培養(yǎng)基:M RS液體培養(yǎng)基和M RS固體培養(yǎng)基按文獻方法配制[9]。MRS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中加入已過濾除菌的水溶性膽固醇(100μg/m L)、膽鹽(3 g/L)、巰基乙醇酸鈉(體積分數(shù)0.2%)。

1.2 主要儀器和試劑

BCN-1360B型無菌超凈工作臺:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn);GENbox厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(bioMérieux),Cary 300 UV-V IS分光光度計:美國Varian公司生產(chǎn);Thermo CR3i高速冷凍離心機:美國 Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn);氮吹儀:上海濟成分析儀器有限公司生產(chǎn);水溶性膽固醇、牛膽鹽、巰基乙醇酸鈉均購自美國Sigma公司;多種抗生素:北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 降膽固醇植物乳桿菌的體外篩選

1)活化菌株:菌液中菌的濃度為3×109CFU

/m L按體積分數(shù)3%接種量接入10 m L滅菌MRSO-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,離心(10 000 g,4 ℃,10 min),取上清。采用鄰苯二甲醛法[10]測定所得上清液膽固醇的含量,以未接菌的M RSO-Oxgall-CHOL培養(yǎng)液作空白對照,對照液的膽固醇含量減去培養(yǎng)液上清膽固醇含量,即得到被測菌體去除的膽固醇量。所得OD值依據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出膽固醇移除量。

1.3.2 耐酸試驗 用1 mol/L鹽酸調(diào)M RS液體培養(yǎng)基到p H值分別為2.0、3.0。菌種活化培養(yǎng)24 h后,按照體積分數(shù)3%的接種量加到p H值為2.0、3.0的液體M RS中,置于37 ℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng),分別于1、2和3 h無菌取出培養(yǎng)菌液50μL,稀釋并涂布于M RS瓊脂平板中[11]。37℃厭氧培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)(以CFU/m L表示)。

1.3.3 菌株耐膽鹽能力測試 試驗設(shè)3、5、10 g/L 3個膽鹽質(zhì)量濃度,以不加膽鹽的培養(yǎng)基為對照。活化后的乳桿菌接種于M RS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,按體積分數(shù)3%接種量分別接種于含不同濃度牛膽鹽的M RS液體培養(yǎng)基中。37℃厭氧培養(yǎng),分別于0 h和4 h無菌取出培養(yǎng)液50μL,稀釋并涂布于M RS瓊脂平板中。培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)。

1.3.4 藥物敏感性試驗 采用最小抑制濃度值法(M IC)[12]。依據(jù)各類抗生素作用機制不同,選擇了抑制細菌細胞壁合成、細菌核酸合成和蛋白質(zhì)合成以及抑制細胞質(zhì)膜的10種常用抗生素。上述10種抗菌藥物根據(jù)不同劑型和不同的溶劑進行倍比稀釋 ,終質(zhì)量濃度為:512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/L。M RS液體培養(yǎng)基添加不同濃度的抗生素,37℃厭氧培養(yǎng)24 h。根據(jù)生長狀況觀察得出菌株對每種抗生素的M IC值。根據(jù)測定的M IC值和M IC臨界點值EUC(EU Commission)的統(tǒng)計參考值,確定菌株對各種抗生素的敏感性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇菌株的體外篩選

9株植物乳桿菌及1株商業(yè)菌(L.rham nosusGG)厭氧條件下在M RS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基中膽固醇的去除能力如圖1所示,實驗菌株均具有較好的膽固醇去除能力,去除量在14.38～22.40 μg/mL。試驗菌株中除SC9膽固醇脫除量(14.38 μg/mL)略低于商業(yè)菌L.rhamnosusGG(14.84 μg/mL)以外,其余均有較強的脫除能力。其中S56的脫除膽固醇的量最高,達到22.40μg/m L。

圖1 乳桿菌對膽固醇的脫除能力Fig.1 Cholesterol removal ability by lactobacilli strains

2.2 耐酸性

耐酸試驗結(jié)果見表1,雖然不同菌株起始活菌數(shù)不同(lg CFU/mL從7.7～8.7),但9株受試菌在p H值3.0、37 ℃條件下培養(yǎng)3 h后,除S38以外活菌數(shù)均超過6.7 lg CFU/m L,菌株的存活率在85%以上。這可能與其在酸菜的高酸度環(huán)境條件下長期馴化有關(guān),從而對酸具有天然的抵抗能力。菌株S2-6、S4-1、S56和 S72的酸耐受能力與陽性對照菌L.rham nosusGG相當(dāng)。菌株 S2-5、S2-6、S4-1、S56在p H值2.0,37 ℃條件下培養(yǎng)1 h后,活菌數(shù)分別為 5.6、5.8、6.0和 6.1 lg CFU/mL。均高出L.rham nosusGG的活菌數(shù)(4.5 lg CFU/mL),說明4株植物乳桿菌具有較強的低p H耐受性能。菌株 S38在p H 2.0,37℃條件下培養(yǎng)1h后,活菌數(shù)為4.0 lg CFU/m L,耐酸能力相對低一些。另外4株菌 SC2、SC9、S72、S52雖在p H值為3.0條件下具有較強的耐酸性,但均不能耐受p H值為2.0。

表1 植物乳桿菌的耐酸性能Tab.1 Acid resistance of Lactobacillus plantarum活菌數(shù)/(lg CFU/mL)

2.3 菌株耐膽鹽能力測試

供試菌株在含質(zhì)量濃度分別為3、5、10 g/L的牛膽鹽培養(yǎng)基中,生長狀況良好,膽鹽耐受能力與陽性對照菌株L.rham nosusGG相當(dāng)。如表2所示。

表2 植物乳桿菌的耐膽鹽情況Tab.2 Bile tolerance of Lactobacillus plantarum活菌數(shù)/(lg CFU/m L)

試驗結(jié)果表明,9株植物乳桿菌在不同程度上對高質(zhì)量濃度牛膽鹽(10 g/L)均有耐受性,活菌數(shù)在7.4 lg CFU/m L以上,菌株存活率在87%以上,且這些菌株均隨著膽鹽濃度的增加,活菌數(shù)具有不同程度的降低。與對照菌L.rham nosusGG結(jié)果一致。菌株S72在膽鹽質(zhì)量濃度5 g/L的條件下的活菌數(shù)比在膽鹽質(zhì)量濃度為 3 g/L時略高。在P.Burns、G. Vinderola等人的研究報道中,L.p lantarum08342和L.plantarum20174在膽鹽質(zhì)量濃度5 g/L的條件下的生長情況也略好于膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L的生長情況[13]。這表明適當(dāng)?shù)哪扄}濃度(如5 g/L)可能刺激某些植物乳桿菌的生長。總之,本研究的9株植物乳桿菌均具有較強的耐膽鹽能力。

2.4 抗生素敏感性試驗

按照1.3.4中所述方法對供試菌株進行藥物敏感性試驗,根據(jù) E-Test結(jié)果判讀手冊讀取實驗結(jié)果,見表3。

在檢測的9株植物乳桿菌中,菌種不同對抗生素的最小抑制濃度也不同。所有菌株均耐受4種或4種以上的抗生素,屬于多重耐藥菌。尤其是對卡那霉素、萬古霉素、多粘菌素B、赤霉素等4種抗生素均表現(xiàn)出強耐藥性,最小抑制質(zhì)量濃度均高于512μg/m L。所有菌株對紅霉素、利福平、氯霉素、青霉素等4種抗生素敏感,這也與選擇的商業(yè)菌株L.rhamnosusGG結(jié)果一致。Sw enson[14]等研究證實許多乳桿菌對糖肽類抗生素-萬古霉素具有耐藥性,Kattla[15]等研究證實乳桿菌對四環(huán)素和氯霉素敏感,本實驗也得出了相同的實驗結(jié)果。

表3 實驗菌株對不同抗生素的最低抑菌質(zhì)量濃度(M IC)Tab.3 Strains minimum inhibitory concentration of different antibiotics(M IC) M IC/(μg/m L)

3 討論與結(jié)語

益生菌是指通過攝取適當(dāng)?shù)牧?對食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌[16]。益生菌在激活機體的免疫系統(tǒng)[17]、緩解腸道炎癥[18]、降低膽固醇[19]和降血壓[20]等方面發(fā)揮重要作用。目前功能益生菌正受到越來越多的關(guān)注,篩選這些功能益生菌成為研究熱點。尤其是一些長期食用安全的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,是功能性益生菌的重要來源[21]。本研究采用體外篩選方法從東北酸菜品來源的乳桿菌中篩選出多株具有降膽固醇功能植物乳桿菌,并有望為今后益生菌和功能性乳制品的研究與開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

經(jīng)口進入機體的益生菌,必須能耐受上消化道的強酸和高膽鹽環(huán)境,并具有良好的粘附性能及定植抗性才能發(fā)揮益生作用。因此,對于具有特定功能的降膽固醇功能的乳桿菌必須能夠耐受低p H值的胃液及腸內(nèi)的高膽鹽環(huán)境才能發(fā)揮其功能性。Pereira等評價了一些分離自人腸道的乳桿菌和雙歧桿菌的體外降膽固醇作用,同時考察了菌株對低p H值和膽鹽的耐受能力[22]。T.D.T.nguyen等報道了從新生嬰兒糞便中分離的植物乳桿菌p H 04在動物體內(nèi)降膽固醇能力及膽鹽耐受性和抗生素敏感性[23]。本研究對篩選出的9株具有較強降膽固醇功能的植物乳桿菌的耐酸及耐膽鹽能力進行了分析。結(jié)果表明實驗菌株均能耐受p H值為3.0的酸度和10 g/L的牛膽鹽。其中菌株S2-6、S2-5、S4-1和S56在p H值為2.0的低酸環(huán)境中能保持生長1h,具有較強的耐酸性。經(jīng)綜合比較,S56對膽固醇的脫除及耐酸、耐膽鹽能力均較高,在藥物敏感性試驗中對各抗生素也表現(xiàn)出一定敏感性。

乳酸菌確切的降膽固醇機理尚不明確,可能的降膽固醇機理包括(1)游離膽酸鹽與膽固醇的共沉淀作用;(2)細菌酶對膽酸鹽的去結(jié)合作用;(3)膽固醇結(jié)合到細菌細胞膜或壁上;(4)細菌對膽固醇的吸收;(5)共沉淀和吸收作用同時發(fā)生。本研究經(jīng)體外篩選獲得了4株具有較強的耐酸、耐膽鹽和降膽固醇等特性的植物乳桿菌,后續(xù)研究有必要將其應(yīng)用于動物體內(nèi)檢測其對血清等膽固醇的影響情況,并進一步分析其降膽固醇的機制。

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In Vitro Cholesterol-Lowering Activity of Potential Probiotic Lactobacillus Plantarum Isolated from Chinese Sauerkraut

YU Zhi-hui1.3, LI Chang-ying2, ZHANG Xue2, L ISheng-yu2, LI Da2, YANG Zhen-nai＊1,2
(1.College of Biological and Agricultural Engineering,Jilin University,Changchun 130118,China;2.Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Jilin Agriculture Science and Technology College,Jilin,132011,China)

NineLactobacillus plantarumstrains were isolated from the Northeast homemade sauerkraut and exhibited high cholestero l-lowering ability.By acid and bile tolerance and antimicrobial susceptibility testing,these strains were studied for their potenticl probiotic.The results showed good cholesterol-lowering ability with S56 giving the highest of cholesterol removal at 22.40μg/mL.A ll the strains could tolerate pH 3.0 and 10 g/L of bovine bile salt.Strains S2-6,S2-5,S4-1 and S56 maintained the grow th for 1h at pH 2.0.

L actobacillus plantarum,cholesterol lowering,in vitro screening

TQ 920.1

A

1673-1689(2011)03-0398-05

2010-05-22

國家自然科學(xué)基金項目(No.30670057)。

于志會(1979-),女,吉林農(nóng)安人,博士研究生,講師,主要從事生物資源保護與利用研究。

Email:yzh_jilin@163.com

＊

楊貞耐(1965-),男,江西廣豐人,工學(xué)博士,研究員,主要從事乳品工藝與生物技術(shù)研究。Email:zyang@cjaas.com