L-纈氨酸高產菌誘變育種的研究

張偉國, 錢和

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122;3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

L-纈氨酸高產菌誘變育種的研究

張偉國1,2, 錢和3

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122;3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)L-纈氨酸產生菌XQ-2為出發菌株,經硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(N TG)逐級誘變處理,氨基酸結構類似物α-氨基丁酸(α-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)和α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)定向篩選,獲得一株L-纈氨酸高產菌 XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrA HVhr)。在以135 g/L葡萄糖為碳源和50 g/L硫酸銨為氮源的培養基中搖瓶發酵72 h,產酸達64～66 g/L。

L-纈氨酸;誘變育種;黃色短桿菌

L-纈氨酸是人體8種必需氨基酸之一,同時又是3種支鏈氨基酸之一,因其特殊的結構和功能在人類生命代謝中占有特別重要的地位,可廣泛應用于食品和醫藥等方面,但由于其生產成本較高,價格較貴,目前主要用于配制復合氨基酸制劑,特別是應用于高支鏈氨基酸輸液(如3H輸液等)和口服液(肝安干糖漿等)。最近,人們發現L-纈氨酸是合成一種治療高血壓的特效藥——纈沙坦的重要中間體,其年消耗量猛增到數千噸。

目前,國際上生產L-纈氨酸均采用發酵法。日本的松琦氏選育的厭氣桿菌在100 g/L的葡萄糖培養基中產酸達15 g/L[1];Tsuchicla等選育的乳糖發酵短桿菌搖瓶產酸達31g/L[2];日本協和公司的L-纈氨酸產酸水平達40～50 g/L[3]。中國科學院微生物研究所于1975年在國內首次報道了L-纈氨酸產生菌北京棒桿菌突變株AS1.586的選育,產酸為26 g/L[4]。“七五”期間中國科學院微生物研究所進行了第二代纈氨酸高產菌的選育,搖瓶產酸提高到30g/L[5]。張偉國選育的黃色短桿菌XQ-2搖瓶產酸達42～45g/L[6];浦軍平等選育L-纈氨酸產生菌種搖瓶產酸達45g/L[7]。張偉國等選育的黃色短桿菌XQ-6搖瓶產酸達58～62g/L[8]。趙麗麗等選育的纈氨酸高產菌TV2564,5 L罐補料分批發酵,產酸達50 g/L[9]。徐慶陽等選育的L-纈氨酸高產菌,10 L發酵罐補料分批發酵72 h,產酸可達53.4 g/L[10]。本試驗對以前選育的L-纈氨酸產生菌 XQ-6定向育種,產酸進一步提高,搖瓶產酸64～66 g/L,50 L發酵罐補料分批發酵68 h產酸高達68.7 g/L。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發菌株為L-纈氨酸產生菌XQ-2(Leul(-ABrAHVr2-TAr)。

1.2 培養基

1.2.1 完全培養基(g/L) 葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨 10、NaCl 5、瓊脂條 25。

1.2.2 基礎培養基(g/L) 葡萄糖20、(NH4)2SO41.5、KH2PO41、K2HPO43、M gSO4·7H2O 0.5、M nSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、VH 30μg/L、VB1·HCl 100μg/L、尿素 1.5、瓊脂粉20。

1.2.3 種子培養基(g/L) 葡萄糖 25、(N H4)2SO45、KH2PO41、M gSO4·7H2O 0.5、玉米漿 35～40、尿素 2.5、CaCO310。

1.2.4 發酵培養基(g/L) 葡萄糖 120～150、(NH4)2SO435～50、KH2PO41、M gSO4·7H2O 0.5、M nSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、VH 25～100μg/L、VB1·HCl 50μg/L、玉米漿5～10、CaCO340。

完全、基礎和種子培養基均以20 g/dL NaOH調p H至7.5～7.6,0.1 M Pa壓力下滅菌20 m in。發酵培養基以20 g/dL NaOH調p H值為7.5～7.6,0.07 M Pa壓力下滅菌8 min。

1.3 主要試劑

硫酸二乙酯(DES)為上海試劑廠產品;亞硝基胍(N TG)為瑞士 Fluka公司產品;(-氨基丁酸((-AB)、α-氨基-β-羥基戊酸 (A HV)和 2-噻唑丙氨酸(2-TA)為美國Sigma公司產品。

1.4 誘變方法

常規化學誘變法[11]。

1.5 氨基酸結構類似物抗性株檢出方法

將氨基酸結構類似物按一定濃度混合于基礎培養基中,制成平板后,涂布上述經誘變處理過的菌體,置30℃恒溫箱中培養3～5 d后長出的大菌落,即是氨基酸結構類似物抗性變異株。

1.6 分析方法

1.6.1 p H值測定 用酸度計測定法。

1.6.2 菌體生長 吸取樣品菌液0.2 m L加到5 m L濃度為0.25 mol/L HCl溶液中,搖勻后測定A562nm值。

1.6.3 葡萄糖 采用SBA-4多功能谷氨酸-葡萄糖分析儀測定。

1.6.4 L-纈氨酸 紙上層析法、比色定量法[12]和氨基酸分析儀測定。

2 結果與討論

2.1 L-纈氨酸高產菌 XQ-6的選育譜系

2.1.1 α-ABhr變異株的獲得 從 XQ-2出發,經DES誘變,高濃度α-AB平板篩選,獲得α-ABhr變異株215株,經搖瓶篩選獲得一株L-纈氨酸高產菌V 5-128,產酸質量濃度為45～47g/L。

2.1.2 2-TAhr變異株的獲得 在獲得 V 5-128的基礎上,經N TG誘變,高濃度2-TA平板篩選,獲得2-TAhr變異株163株,其中有幾株L-纈氨酸積累有不同程度的增加,代表性株V 6-56的產酸達55～56 g/L。

2.1.3 A HVhr變異株的獲得 繼續由N TG誘變,高濃度A HV平板篩選,獲得AHVhr變異株98株,其中有幾株L-纈氨酸積累有不同程度的增加,代表性株V 7-87的產酸達60～62 g/L,經單菌落分離發酵條件優化,產酸穩定在64～66 g/L。

2.1.4 L-纈氨酸高產菌XQ-8的選育譜系 從選育的L-纈氨酸產生XQ-2出發,經DES和N TG誘變處理,L-纈氨酸結構類似物定向選育,得到L-纈氨酸高產菌XQ-8,具體選育譜系見圖1。

2.2 L-纈氨酸高產菌 XQ-8發酵條件的研究

圖1 L-纈氨酸高產菌XQ-8的選育譜系Fig.1 Schematic chart of mutagensis procedure for L-valine producer XQ-08 Superscript l-leaky mutant r-resistance hr-high resistance

2.2.1 各種營養物質對產酸的影響 考察了生物素對XQ-8菌株L-纈氨酸發酵的影響。結果表明,生物素為XQ-8菌株生長和產酸的唯一必需因子,缺之,菌體不能生長和產酸 (見圖2)。當生物素添加質量濃度為40～50μg/L時,可獲得較高的L-纈氨酸積累。由于只添加純生物素時前期菌體生長較慢,故進行添加生物素同時添加少量玉米漿發酵試驗,結果表明,當添加40～50μg/L生物素和0.5 g/dL玉米漿時,L-纈氨酸積累最高,達64～66 g/L(見圖 3)。

圖2 生物素對L-纈氨酸發酵的影響Fig.2 Effect of biotin on L-valine production

圖3 添加玉米漿時生物素對L-纈氨酸發酵的影響Fig.3 Effect of the additional corn steep liquor and biotin on L-valine production at one time

添加支鏈氨基酸(L-亮氨酸和L-異亮氨酸),當濃度較低(≤2 g/L)時,對L-纈氨酸發酵的影響不大(如圖4所示);只有當支鏈氨基酸的濃度較高(≥6 g/L)時,則影響較大(如圖5所示)。

圖4 L-亮氨酸對L-纈氨酸發酵的影響Fig.4 Effect of L-leucine on L-valine production

圖5 L-異亮氨酸對L-纈氨酸發酵的影響Fig.5 Effect of L-isoleucine on L-valine production

2.2.2 XQ-8菌株L-纈氨酸最佳發酵條件 應用正交試驗法綜合考察了培養基成分、種齡、接種量等多種因素對菌株產酸的影響,得到的最佳發酵條件列于表1。

表1 L-纈氨酸搖瓶發酵的最佳條件Tab.1 Optimal fermentation condition for L-valine production

2.2.3 XQ-8菌株L-纈氨酸發酵進程曲線 圖6為-纈氨酸高產菌XQ-8的典型發酵過程曲線。圖6中,0～12 h為菌體生長延滯期,此時菌體耗糖速率較慢,主要用于長菌,基本不產酸;13～36 h為菌體生長對數期,此時生長速率達到并保持最大,耗糖速率明顯加快,并開始產酸;37～64 h進入菌體穩態生長期,此間耗糖速率較快,L-纈氨酸大量合成;65～72 h為衰亡期,此間耗糖速率減慢,直到發酵結束。

圖6 L-纈氨酸發酵過程曲線Fig.6 Time-course of L-valine production

3 結 語

L-纈氨酸與L-亮氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑是相關的,這3種氨基酸的生物合成,存在著共同的酶,因此代謝調節機制較為復雜。在合成途徑中存在:(1)纈氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)有抑制作用;(2)纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)有多價阻遏作用。

L-纈氨酸生物合成的限速酶為α-乙酰羥基酸合成酶(AS)。因此,如果要在培養基中積累大量L-纈氨酸,就必須解除正常的反饋調節,即解除L-纈氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的反饋抑制及L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的多價阻遏。α-AB為L-纈氨酸的結構類似物,其高濃度抗性突變株可解除了L-纈氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的反饋抑制;2-TA為L-纈氨酸和L-亮氨酸的結構類似物,其高濃度抗性突變株也同樣可解除了L-纈氨酸和L-亮氨酸對α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的多價阻遏,使得AS的酶活極大幅度地提高,其結果在培養基中積累大量L-纈氨酸;AHV為蘇氨酸的結構類似物,其抗性突變株為何能提高L-纈氨酸的積累?其機制尚沒有解明,是否存在A HV抗性可解除異亮氨酸對AS的多價反饋調節,這一點值得進一步探討。

（References）：

[1]木下祝郎.L-纈氨酸菌種的選育[M].新版發酵工業,1974,(1):5.

[2]張克旭.氨基酸發酵工藝學[M].北京:中國輕工業出版社,1992,678.

[3]馮容保.氨基酸的工業生產[J].發酵科技通訊,2000,29:1.FENG Rong-bao.Industry production of amino acid[J].Fa Jiao Keji Tongxun,2000,29:1.(in Chinese)

[4]中國科學院微生物研究所氨基酸組.L-纈氨酸產生菌AS1.586的選育.微生物學報,1975,15(4):325～330.

Institute of Microbiology of CAS.Breeding of L-valine producer AS1.586[J].Acta Microbiol Sin.1975,15(4):325～330.(in Chinese)

[5]王秀嶺,屈明波,黃和容.多重抗性突變株L-纈氨酸發酵[J].微生物學通報,1990,17(5):276～279.

WANG Xiu-ling,QU Ming-bo,HUANG He-rong.A multi-resistances mutant for L-valine producer[J].Microbiology.1990,17(5):276～279.(in Chinese)

[6]張偉國,錢和.L-纈氨酸菌種的選育[J].無錫輕工業大學學報,1995,(3):221-224.

ZHANGWei-guo,Q IAN He.Breeding of L-valine producer[J].Journal of Wuxi University of L ight Industry,1995,(3):221-224.(in Chinese)

[7]浦軍平,肖泉,林學軍.一次性高搪發酵L-纈氨酸菌種選育及發酵條件[J].大連輕工業學院學報,2001,20(4):264-267.

PU Jun-ping,XIAO Quan,L IN Xue-jun.Selective breeding process and fermenting condition of L-valine in highglucoside[J].Journal of Dalian Institute of Light Industry,2001,20(4):264-267.(in Chinese)

[8]張偉國,錢和.L-纈氨酸高產菌選育及營養需求研究[J].沈陽藥科大學學報,2001,18(6):443-446.

ZHANG Wei-guo,Q IAN He.Study on the breeding of L-valine hyper-producer and its requirement for nutrients[J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University.2001,18(6):443-446.(in Chinese)

[9]趙麗麗,張蓓,陳寧等.L-纈氨酸補料分批發酵的研究[J].南開大學學報:自然科學,2002,35(4):106-110.

ZHAO Li-li,ZHANG Pei,CHEN Ning.Studieson the feed batch fermentation of L-valine[J].Acta Scientiarum Naturalium University Nankaiensis.2002,35(4):106-110.(in Chinese)

[10]徐慶陽,劉樹海,陳寧.L-纈氨酸的發酵工藝研究[J].生物技術通訊,2006,17(3):381-386.

XU Qing-yang,LIU Shu-li,CHEN Ning.Study on the fermentation process of L-valine produced by brevibacterium flavum[J].Letters in Biotechnology.2006,17(3):381-386.(in Chinese)

[11]章名春.工業微生物誘變育種[M],北京:科學出版社,1984

[12]潘家秀.蛋白質化學研究技術[M],北京:科學出版社,1962

Studies on the Breeding of L-Valine Hyper-Producing M utan t

ZHANGWei-guo1,2, Q IAN He3
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;3.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

U singB revibacterium flavumXQ-2(Leul(-ABrA HVr2-TAr)as a starting strain for stepwise mutagenesis by diethylsulfate (DES),N-methyl-N’-nitro-soguanidine (N TG)treatment,a L-valine hyper-producing mutant XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrAHVhr)was obtained,w hich could be resistant to high concentrationα-amino-butyric acid(α-AB),2-thiazole-DL-alanaine(2-TA)andα-amino-β-hydroxy-valeric acid(AHV).A s a result,high L-valine concentration(64～66g/L)was obtained with shaking at 31±1℃for 72h in the medium containing 135g/L glucose and 50g/L(NH4)2SO4.

L-valine,breeding,brevibacterium flavum

TQ 922

A

1673-1689(2011)03-0394-04

2010-05-25

國家863計劃項目(2008AA 02Z212)。

張偉國 (1963-),男,江蘇張家港人,工學博士,教授,博士研究生導師,主要從事氨基酸生產菌選育和發酵工藝控制研究。Email:zhangw g168@126.com