統計學分析方法在普魯蘭發酵培養基優化中的應用

張益波, 趙藝, 柴玉爽, 韓微, 薛雪,王菲, 王愛敏, 逯家輝, 滕利榮＊

(1.吉林大學生命科學學院吉林長春 130012;2.吉林大學珠海學院廣東珠海 519041)

統計學分析方法在普魯蘭發酵培養基優化中的應用

張益波1, 趙藝2, 柴玉爽1, 韓微1, 薛雪1,王菲1, 王愛敏1, 逯家輝1, 滕利榮＊1

(1.吉林大學生命科學學院吉林長春 130012;2.吉林大學珠海學院廣東珠海 519041)

為了得到普魯蘭發酵的最佳培養基,在單因子實驗的基礎上,應用Plackett-Burman設計法對影響普魯蘭發酵的基本培養基組分中的關鍵因子進行了優選,并進一步采用響應面分析法(Response Surface M ethodology,RSM)對影響普魯蘭產量的關鍵因素最佳水平范圍作了深入的研究。實驗結果表明:影響普魯蘭產量的關鍵因素為:葡萄糖、酵母粉和NaCl的濃度。通過RSM模型的擬合和推算得到在葡萄糖、酵母粉和NaCl質量濃度分別5.675、0.405、0.0815 g/dL時,此時模型預測發酵最佳的產量為32.071 44 g/L,驗證值為32.16 g/L,預測值與驗證值之間吻合較好,比原始培養基提高了約5倍。

普魯蘭產生菌;Plackett-Burman設計法;響應面法(RSM)

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一種多形態真菌,在其酵母狀細胞內可分泌一種短梗霉多糖,又稱普魯蘭(Pullulan)[1],其分子由麥芽三糖以α-1,6-糖苷鍵連接而成。由于普魯蘭具有可食性、無毒害、無污染、可塑性好等特點,在食品,醫藥,輕工業生產等方面具有廣泛的應用前景[2,4]。在國外,普魯蘭的研究和生產早已成為熱點[5],中國內普魯蘭的發酵生產研究處于起步階段,對普魯蘭發酵進行培養基的優化的研究較少。為了獲得較高的普魯蘭產量和普魯蘭發酵過程中培養基因子之間的影響進行研究,我們進行了統計學分析方法的優化。

Plackett-Burman設計法是一種兩水平的實驗設計的經典方法。它可以利用最少的實驗次數,從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的因子,被廣泛地用于因子主效應的估計中[6]。響應曲面法(Response Surface Methodology,RSM)是一種優化生物過程的綜合技術,該法可以建立連續變量曲面模型,在建立可靠模型的基礎上對影響生物產量的因子水平及其交互作用進行優化與評價,它可快速有效的確定生物過程的最佳條件,該法在各種探索工藝的優化實踐中被廣泛應用[7-10]。

本研究利用 Plackett-Burman和響應曲面法(Response Surface Methodology,RSM)等統計學的實驗設計方法確定及優化普魯蘭菌深層發酵的培養基,以期得到最佳的培養基,增加普魯蘭產生菌發酵過程中的普魯蘭產量,為后續放大發酵培養和普魯蘭的廣泛應用提供依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗菌株

菌種:普魯蘭產生菌 A TCC16623,購于A TCC。

1.2 主要試劑

蒽酮,濃硫酸,葡萄糖,酵母粉等試劑均為分析純,購于國藥集團。

1.3 培養基

固體培養基:PDA培養基。

液體培養基(g/dL):葡萄糖 5,磷酸二氫鉀0.6,酵母粉0.3,硫酸銨0.06,七水合硫酸鎂0.02,氯化鈉0.05,p H 6.0,120℃滅菌30 min。

1.4 實驗儀器

SHB-III型循環水式多用真空泵:鄭州長城科工貿公司產品,PX-150-Z恒溫搖床:上海躍進醫療器械廠生產,SAN YO全自動高溫滅菌器:日本,101A-2E電熱恒溫干燥箱:上海實驗儀器廠生產,電子分析天平(d=0.001 g):德國賽多利斯公司產品,752紫外可見分光光度計:上海分析儀器廠產品。

2 實驗方法

2.1 普魯蘭產量的計算

將深層發酵得到的發酵液抽濾、離心后留上清液;4℃,體積分數80%醇沉過夜,離心去上清液,不容物烘干后用適量的水溶解,使用蒽酮-硫酸法[11]測定普魯蘭的含量。

2.2 實驗設計

2.2.1 起始發酵培養基的確定 以葡萄糖5 g/dL,KH2PO40.6 g/dL,酵母粉 0.3 g/dL,(NH4)2SO40.06 g/dL,M gSO4·7H2O 0.2 g/dL,NaCl 0.05 g/dL為基本培養基進行單因子碳源、氮源種類和濃度,無機鹽濃度的優化研究。發酵條件為[12]:接種體積分數為4%,發酵溫度為28 ℃,搖床轉速為120 r/min,發酵96 h。

2.2.2 影響普魯蘭產量主要因素的確定 用Plackett-Burman試驗設計確定起始培養基中6種成分對普魯蘭產量的影響進行研究,以回歸分析的方法確定影響較大的因子。依據已確定的起始發酵培養基,選取培養基的6種成分作為6個因素進行考察。本試驗采用N=12 Plackett-Burman設計,并余留2個空項作為誤差分析[13]。

2.2.3 中心組合優化培養基的確定 根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理的實驗分析結果[15],采用響應面分析法在三因子三水平上對普魯蘭的發酵工藝進行優化。選取響應值為普魯蘭產量,自變量為顯著因子水平,得到響應面的二階經驗模型:

式中:Y為模型響應值,即普魯蘭常量,b為回歸系數,xi為自變量的編碼水平,它與自變量真實值Xi的關系為:

式中:Xi0為實驗中心點處自變量的真實值,ΔXi為自變量變化步長。

3 結果與討論

3.1 單因子實驗結果

3.1.1 碳源和氮源種類的選擇 培養基其它成分和含量不變選取不同種類的碳源和氮源進行實驗。

圖1 碳源和氮源種類對普魯蘭產量的影響Fig.1 Effects of carbon and nitrogen sources on Pullulan production

從圖1(a)中可以看出在其它培養基成分不變的情況下,同等質量濃度的不同碳源在普魯蘭產生菌的發酵培養過程中,葡萄糖作為碳源對普魯蘭的產量最有利,所以實驗中選擇葡萄糖為碳源。從圖1(b)中可以看出在其它培養基成分不變的情況下,同等質量濃度的不同氮源在普魯蘭產生菌的發酵培養過程中,酵母粉作為碳源對普魯蘭的產量最有利,所以實驗中選擇酵母粉為碳源。

3.1.2 培養基濃度單因子優化的結果 以優化后的培養基種類進行培養基質量濃度選擇的單因子實驗。實驗中分別選擇合適的范圍對葡萄糖、酵母粉、KH2PO4、(NH4)2SO4、M gSO4·7H2O 和 NaCl的質量濃度進行了研究,研究結果見圖3。

圖2 培養基質量濃度單因子對普魯蘭產量的影響Fig.2 Effects of medium concentration on Pullulan production

由圖2(a)中可以看出隨著葡萄糖質量濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當葡萄糖質量濃度為5.5 g/dL時,普魯蘭的產量達到最大值7.47 g/L。故選擇葡萄糖質量濃度為5.5 g/dL。圖2(b)中可以看出隨著酵母粉濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當酵母粉質量濃度為0.40 g/dL時,普魯蘭的產量達到最大值7.97 g/L。故選擇酵母粉質量濃度為0.40 g/dL。圖2(c)中可以看出隨著 KH2PO4濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當 KH2PO4濃度為0.65%時,普魯蘭的產量達到最大值8.1 g/L。故選擇 KH2PO4質量濃度為0.65 g/dL。圖2(d)中可以看出隨著(NH4)2SO4質量濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當(NH4)2SO4質量濃度為0.05 g/dL時,普魯蘭的產量達到最大值8.36 g/L。故選擇(NH4)2SO4質量濃度為0.05 g/dL。圖2(e)中可以看出隨著M gSO4·7H2O質量濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當M gSO4·7H2O質量濃度為0.07 g/dL時,普魯蘭的產量達到最大值8.712g/L。故選擇M gSO4·7H2O質量濃度為0.07 g/dL。圖2(f)中可以看出隨著NaCl質量濃度的增加,普魯蘭的產量表現為現增加后減小,當NaCl質量濃度為0.08 g/dL時,普魯蘭的產量達到最大值10.5 g/L。故選擇NaCl質量濃度為0.08 g/dL。

3.2 影響普魯蘭產量主要因素確定的結果(Plackett–Burman Design)

應用SAS實驗設計工具箱設計8因子的12次的 Plackett-Burman試驗安排見表1,分析過程采用統計學上的t-檢驗。利用SASV 9.0軟件進行試驗設計、數據分析。

表1 N=12 Plackett-Burman試驗設計與結果Tab.1 Results of Plackett-Burman design experiments

實驗中照表1的安排進行Plackett–Burman實驗,應用12種不同質量濃度的培養基進行普魯蘭產生菌的發酵培養,分別得到對應的普魯蘭產量,對 Plackett-Burman的試驗結果進行多項式的回歸分析得到的方程如下:

方程擬合的相關性為R2=98.26%,表明此多項式方程很好的模擬和解釋了Plackett-Burman的實驗結果。對普魯蘭發酵產量的 Plackett–Burman實驗t-檢驗結果見表2。培養基6個成分的t-檢驗結果表明:葡萄糖的濃度對普魯蘭產量影響非常顯著(P=0.001 216),其次培養基中的NaCl(P=0.063 981)和酵母粉(P=0.095 956)的濃度對普魯蘭的產量影響顯著,其它因子的影響不顯著。由t檢驗的結果分析看出,適當增加這3種培養基成分的質量濃度對普魯蘭的產量是有利的。

表2 Plackett–Burman試驗各因素參數的 t-檢驗分析結果Tab.2 Regression analysisand t-test of the Plackett– Burman design experiments

3.3 中心組合實驗結果

3.3.1 預測模型的建立和回歸分析檢驗 以單因子實驗和Plackett–Burman實驗結果進行三因素三水平的中心組合實驗,實驗方案及對應的發酵普魯蘭產量結果見表3。

表3 中心組合實驗設計和結果Tab.3 Results of the Box-Behnken design experiments

續表1

用SASV 9.0的實驗設計工具箱對實驗數據進行回歸擬合,并對擬合方程和相關的因子作顯著性t-檢驗及方差分析,可以得到響應面方程和普魯蘭產量的最佳發酵培養條件,應用Matlab7.5進行響應面和等高線直觀分析圖形的制作。

經過SASV 9.0對中心組合數據進行處理,得到二次響應面回歸方程為:

式中:Y為響應值普魯蘭產量,X1、X2和X3分別為葡萄糖、酵母粉和NaCl濃度的編碼值。同時對擬合模型進行方差分析,模型的方差分析結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計回歸分析結果Tab.4 Regression analysis of the Box-Behnken design experiments

續表4

從模型的方差分析結果(表4)可以看出模型的P(Pr>F)值為0.002 365,說明模型回歸非常顯著說明模型擬和得較好。此外,模型的預測值和真實值相關性高,模型的線性、平方和交互項回歸均非常顯著[P(Pr>F)<0.05]相關系數為R2=97.16%。這些結果表明了擬合的二次響應面方程很好的解釋了中心組合實驗,可以用其代替真實試驗點進行普魯蘭發酵培養最優條件的預測。方程中的各個因子對響應值的影響關系可以通過t-檢驗進行研究,表6給出了回歸模型的系數顯著性檢驗的結果。模型系數的顯著性t-檢驗結果表明,回歸方程的一次項X1和平方項X1X1、X2X2、X3X3對模型的影響非常顯著[P(Pr>F)<0.01],同時回歸方程的一次項X2、X3和交互項X1X2對模型的影響顯著[P(Pr>F)<0.05]。說明了模型的因子和響應值變化相對復雜性,不是簡單的線性關系,曲面效應顯著。

3.3.2 普魯蘭產量的響應面分析與優化 由擬合的二次項方程在給定的因子范圍內使用Matlab 9.0作圖可以得到用于分析的響應面和等高線直觀圖,由于X1X2交互項的影響顯著,圖 3給出了X1、X2項對模型的交互作用的分析圖。

圖3 Y=f(X1,X2)的響應面和等高線分析圖Fig.3 Y=f(X1,X2)of responsive surfaces and contours plots

從圖中可以看出,在編碼值為-1～0之間時,隨著X1(葡萄糖)和X2(酵母粉)的增加,響應值Y增加后緩慢減少。X1在低濃度時,隨著X2的增加,Y值先增加后減小表現了非線性的關系,在X1(葡萄糖)編碼值在0.5以上時,X2(酵母粉)增大時,響應值Y先增加后減少也表現了很強的非線性的關系,這與t檢驗分析的結果中出的X1X2交互項對模型的影響顯著(P=0.022 21)相對應。

響應面的最高點和等高線的中心點在此范圍內,可以知道在所選的區域有最大的Y值。同時由二次響應面方程可以得到極值點的編碼值為:X1=0.438 714,X2=0.130 984,X3=0.367 401;即為葡萄糖質量濃度為5.675 g/dL,酵母粉質量濃度為0.405 g/dL,NaCl質量濃度0.0815 g/dL,此時最大的響應值 Y(普魯蘭產量)為32.071 44 g/L。

3.4 驗證實驗

為了對模型擬合和推算的結果進行準確性的檢驗,配置模型推算的最優普魯蘭發酵培養基進行發酵實驗,三次實驗的平均結果為32.16 g/L。與計算值的相對誤差為0.276%,在模型的允許的誤差范圍之內。說明上述的統計學方法對普魯蘭生產的培養基優化是合理可行的,模型能較好地預測實際發酵情況和結果,得到的推算結果可是在實際生產中應用。

4 結 語

1)本文在單因子培養實驗的基礎上確定了培養基的碳氮源種類和各種培養基成分的基本配比。通過Plackett–Burman試驗對6個因子進行了相關因素的篩選,發現了對普魯蘭具有顯著影響的是葡萄糖,酵母粉和NaCl。增加這3種成分的含量對普魯蘭的發酵生產是非常有利的。

2)以單因子確定的最優濃度為響應面分析的中心點,進行三因素三水平的響應面分析實驗,對實驗的結果進行二次回歸曲線的合理擬合,并用統計學的方法進行分析,尋找到了對普魯蘭產量影響較大的因子。經過響應面分析得到了最優的培養基結果為:葡萄糖質量濃度為5.675 g/dL,酵母粉質量濃度為0.405 g/dL,NaCl質量濃度0.0815 g/dL,(NH4)2SO4質量濃度為0.05 g/dL,KH2PO4質量濃度為0.65 g/dL,M gSO4·7H2O質量濃度為0.07 g/dL,此時普魯蘭的產量為32.16 g/L,普魯蘭的產糖量明顯的提高。由此可見,利用響應面法對普魯蘭的培養基進行優化不僅省時省力,而且科學有效。本試驗利用該方法建立的數學模型,不僅有利于數學統計分析,更重要的是它能根據實際生產中培養基組分的特性,選擇培養基各組分的水平;同時能夠達到產物的最大產量,對不同培養條件下發普魯蘭產量的預測,有利于對普魯蘭產生菌發酵過程的控制,為生產實際提供很好的指導作用。

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Statistical Optimization of Fermentation Medium for Pullulan by Au reobasidium pullulans

ZHANG Yi-bo1, ZHAO Yi2, CHA I Yu-shuang1, HAN Wei1, XUE Xue1,WANG Fei1, WANG Ai-ming1, LU Jia-hui1, TENG Li-rong＊1
(1.College of Life Science,Jilin University,Chang chun 130012,China;2.Zhuhai College,Jilin University,Guangdong Zhuhai,519041,China)

In o rder to obtain the optimal medium composition for Pullulan production,statistical method was used to investigate the medium components for pullulan concentration by A ureobasidium pullulans in this study First,the Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six variables including glucose,yeast extract,KH2PO4,M gSO47H2O,(NH4)2SO4and NaCl.Subsequently,a three-level three-factor Box-Benhnken design was employed to determine the maximum Pullulan production at optimum concentration of glucose,yeast extract and NaCl.The optimal values of the three parameters determined by RSM were glucose 5.675%,yeast extract 0.405%and NaCl 0.0815%.The Pullulan production was 32.1g/L,and the actual experimental result was 32.16g/L.They were in well agreement and it is 5.0 folds of thePullulan production before optimization.

A ureobasid iumpullulans,plackett-burman design,response surface analysis methodology(RSM)

Q 939

A

1673-1689(2011)03-0403-07

2010-05-17

吉林大學國家級生物實驗教學示范中心創新基金項目(ZXCX2006012)。

張益波(1982-),男,江蘇宿遷人,博士研究生,主要從事生物技術制藥的研究。

Email:zhangyb08@mails.jlu.edu.cn

＊

滕利榮(1954-),男,吉林扶余人,教授,博士研究生導師,主要從事生物技術制藥研究。Email:tenglr@jlu.edu.cn