O-苯甲酰殼聚糖的合成及其抑真菌活性

馮永巍, 夏文水＊, 申麗麗, 趙云杰

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

O-苯甲酰殼聚糖的合成及其抑真菌活性

馮永巍1,2, 夏文水＊1,2, 申麗麗1,2, 趙云杰1,2

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

以甲烷磺酸為催化劑和氨基保護劑,苯甲酰氯與殼聚糖酯化合成了O-苯甲酰殼聚糖。產物結構經FITR和1H-NMR光譜分析,酯化反應發生在殼聚糖的羥基,游離氨基得到了很好保護,平均取代度為0.35。以灰霉病菌Botry tis cinerea為受試菌種,研究了O-苯甲酰殼聚糖抑制真菌的活性,結果表明:殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖的有效中質量濃度(EC50)分別為1.55 mg/m L和0.27 mg/m L,O-苯甲酰化殼聚糖的抑真菌活性顯著提高。

殼聚糖;O-苯甲酰化殼聚糖;抑真菌活性

殼聚糖是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的生物大分子聚合物,具有促進傷口愈合、降低膽固醇、抑制微生物生長等多種生理活性[1-3]。由于具有低毒、生物可降解、能抑制多種微生物生長的特點,殼聚糖被視為開發高效、無毒的新型食品防腐劑的理想基質。然而,殼聚糖本身的防腐抗菌效果弱于目前廣泛使用的食品防腐劑,無法直接替代這些防腐劑在食品中的應用[4],有必要通過化學改性的方法將其他的抑菌基團引入殼聚糖分子中提高其抑菌活性。

殼聚糖分子中的氨基和羥基都是高活性的反應位點。N-alkyl、N-benzyl、N,O-acyl殼聚糖衍生物都被證實了對細菌和包括灰霉病菌Botry tis cinerea在內的真菌具有一定的抑制作用[5-7]。但有關選擇性的O-酰化殼聚糖衍生物的研究報道并不多,這是因為,殼聚糖氨基的反應活性高于羥基,制備過程中需要進行氨基的保護和脫保護,步驟復雜。然而,殼聚糖的游離氨基被認為是殼聚糖發揮抑菌等生理活性的功能基團,氨基攜帶的正電荷與微生物細胞表面的負電荷相互作用,是引起細胞表面的劇烈改變和細胞的滲透性變化,從而導致細胞死亡主要原因[8]。因此,本研究利用甲烷磺酸在反應中與氨基成鹽對氨基進行保護,在保留游離氨基的基礎上,將強抑菌基團苯甲酸引入到殼聚糖分子,酯化合成具有雙抑菌基團的O-苯甲酰殼聚糖衍生物。選擇引起植物病害的灰霉病菌B.cinerea為受試菌種,對O-苯甲酰殼聚糖的抑真菌作用進行了研究,為殼聚糖類食品防腐劑的開發和分子設計進行了有益的探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖,脫乙酰度(DD)=80%,相對分子質量為3×105為南通雙林生物有限公司產品;馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、瓊脂,生化試劑;苯甲酰氯,甲烷磺酸,丙酮,氨水等均為分析純為國藥集團化學試劑有限公司產品;灰霉病菌Botrytis cinerea,由作者所在的江南大學食品學院微生物實驗室提供

1.2 儀器設備

SPX型智能生化培養箱:南京實驗儀器廠生產;RW 20 DZM.n機械攪拌器:上海試驗儀器有限公司生產;SHB-Ⅲ循環水多用真空泵:鄭州長城科工貿有限公司生產;5DDXB FT-IR紅外光譜儀、美國Nicolet公司生產;B rucker ARX400核磁共振儀:德國Brucker公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 O-苯甲酰殼聚糖酯的合成 稱取干燥的殼聚糖1.7 g,加入25 m L甲烷磺酸,0～5℃不斷攪拌30 min。當殼聚糖完全溶解后,逐滴滴加與氨基葡萄糖等摩爾比的苯甲酰氯,劇烈攪拌反應3 h,于-18℃冷凍過夜。反應液在丙酮中沉淀。沉淀在去離子中水溶解,用氨水溶液調節p H值到7.0,沉淀析出。丙酮索氏抽提沉淀24 h,真空干燥,得到淡黃色粉末苯甲酸殼聚糖酶的合成路線,見圖1。

1.3.2 產物表征

1)產物的紅外光譜 FITR KB r壓片法,在波數4 000～400 cm-1范圍記錄苯甲酰殼聚糖的 FITR圖譜。

2)核磁共振光譜1H NMR1H NMR在70℃溫度下進行,以 TM S為內標,樣品溶解于體積分數2%的DCl D2O溶液。

1.3.3 抑真菌活性的測定

1)菌絲生長測定法[8]將殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖分別溶解于體積分數1%的冰醋酸溶液中,用1 mol/L NaOH調整溶液p H值至5.5～6.0。將上述溶液添加到直徑9 cm的滅菌PDA平板培養基中 ,制成濃度 0、0.75、1.50、3.0、6.0 mol/m L含藥培養基。在已經培養7 d的B.cinereaPDA培養基的邊緣截取直徑6 mm供試菌餅移入到含藥培養基中心。暗處(26±2)℃培養,每個處理重復4次。待對照組(0 mg/mL)菌落接近長滿平板時,用十字交叉法測量菌落直徑,并計算抑菌率,公式如下:

圖1 苯甲酸殼聚糖酯的合成路線Fig.1 Synthetic route of O-benzoyl-chitosan

I=[(dc-dt)/dt-dp)]×100%

式中,I為抑制率;dc為對照菌落直徑;dt為處理菌落直徑;dp為菌餅直徑

2)抑制率回歸方程的建立 以濃度的對數值(X)和抑制率的對數值(Y)建立抑制率回歸方程。求出有效中濃度(EC50),其中EC50為抑制率達到50%抑菌劑的濃度。

3)實驗數據統計分析 采用統計分析軟件SPSS,對實驗數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 產物的表征

2.1.1 產物的FTIR譜圖 殼聚糖與O-苯甲酸殼聚糖的紅外光譜見圖2。與殼聚糖相比,O-苯甲酰殼聚糖在波數1 730、1 260 cm-1處出現新的吸收峰,可歸屬為酯鍵中的C=O鍵和C—O鍵的伸縮振動吸收。1 500～1 400 cm-1吸收峰,為取代基苯環的骨架的振動吸收。并且在1 599 cm-1處仍保留了游離—NH2特征吸收峰。綜合以上結果,苯甲酰基通過酯化反應被引入到殼聚糖分子中,反應主要在殼聚糖的羥基上進行,C2位的-NH2在反應中得到了很好的保護。

圖2 產物的紅外圖譜Fig.2 FITR spectrum of the synthesized compound

2.1.2 產物的1H-NMR1H-NMR數據δ=2.27×10-6(1.12H)為乙酰基上甲基的化學位移;δ=3.42×10-6(2.41H)為氨氫葡萄糖環上C2位CH的化學位移;δ=3.83～4.29×10-6(14.47H)為乙酰氨基葡萄糖環上C2-C6位CH的化學位移;δ=7.64～8.15×10-6(5.22H)為苯環上的CH的化學位移。

2.1.3 取代度的計算,公式如下

其中,DS為取代度;X為游離氨基比例;B為C2位CH的積分面積;C為乙酰氨基葡萄糖C2-C6位CH的積分面積;D為取代基上各個 H積分面積;n為取代基上氫的個數。

經過計算X=0.81,DS=0.35。游離氨基質量濃度與母體殼聚糖基本一樣,說明酯化反應主要發生在羥基,氨基沒有參與反應。此前,也有報道選擇性合成了O-酰基殼聚糖衍生物O,O-二癸酰殼聚糖和O-琥珀酰殼聚糖[9]。這些衍生物的合成需要鄰苯二甲酸酐對氨基進行保護,酯化后在水合肼中脫去氨基保護,得到最終產物,步驟繁瑣,產率低。本研究采用的是一步反應法制備O-酰化殼聚糖。在反應中,甲烷磺酸既是溶劑又是催化劑。當在殼聚糖溶解在甲烷磺酸中時,甲烷磺酸會與殼聚糖分子中的氨基形成鹽,并同C6位-OH和C3位-OH形成弱酯。此時,殼聚糖分子中的氫鍵被破壞,分子間距離增大,分子鏈呈擴張狀態,因而在甲烷磺酸中形成均相體系,有利于O-酰化反應的發生,催化效率較高。當體系中加入酰氯后,由于酰氯具有較強的親電性,進攻弱酯,發生酯交換,從而形成新酯,由于殼聚糖的氨基與甲烷磺酸已成鹽,不與酰氯發生反應。反應結束后向體系中加入氨水進行中和,甲烷磺酸與氨水生成的鹽溶于水,因此可使平衡移動,使產物的氨基以自由形式存在,得到O-酰化殼聚糖產物。

2.2 O-苯甲酰殼聚糖的抑真菌活性

根根據1.3.3中的方法,得到不同濃度的殼聚糖及O-苯甲酰殼聚糖對B.Cinerer的抑制率,見表1。殼聚糖對B.cinerea具有一定的抑制作用,抑菌活性隨著質量濃度的增加而增強。但在低質量濃度時(0.75～1.5 mg/m L)表現出很低的抑菌活性,抑制率不到50%,即使當質量濃度達到6.0 mg/mL時也只能抑制B.cinerea菌絲的生長,而不能完全將其殺死,與Ahmed El Ghaouth的研究成果一致,說明殼聚糖抑真菌的作用有限,這可能與殼聚糖本身就是一些真菌細胞壁的成分有關[9]。通過化學改性將苯甲酸分子引入到殼聚糖分子中,顯著提高了殼聚糖在各濃度下的抑真菌活性,O-苯甲酰殼聚糖在較低濃度對B.cinerea菌絲的生長就有比較強的抑制作用,質量濃度達到6.0 m g/m L時,幾乎可以完全抑制B.cinerea菌絲的生長。Rabea EI合成了一系列N-苯甲酰殼聚糖的衍生物[10],與O-苯甲酰殼聚糖相比,這些衍生物對真菌的抑制作用并不顯著,可能是因為游離氨基被屏蔽的結果。殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對B.cinerea抑制作用回歸方程見表2,通過方程求出了對B.cinerea的EC50分別為1.55和0.27 mg/m L,說明殼聚糖同過苯甲酰化改性后,其抑真菌活性有了顯著提高。

表1 殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對B.cinerea的抑制作用Tab.1 Inhibitive effect of chitosan and O-benzoyl-chitosan on radial growth of B.cinerea

表2 殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對B.cinerea抑制作用回歸方程Tab.2 Regressive equation of chitosan and O-benzoyl-chitosan against B.cinerea

3 結 語

在甲烷磺酸作為催化劑和氨基保護劑的體系中,成功地合成了O-苯甲酰殼聚糖。酰化反應發生在殼聚糖的-OH,C2位的-NH2得到了很好保護,產物平均取代度為0.35。殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖抑制B.cinerea生長的 EC50分別為 1.55和 0.27 mg/mL,表明 O-苯甲酰殼聚糖對灰霉病菌B.cinerea的抑制作用較強,高于其母體殼聚糖。

（References）：

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[10]Badaw y M E I,Rabea E I,Rogge T M,et al.Synthesis and Fungicidal Activity of New N,O-Acyl Chitosan Derivatives[J].Biomacromolecules,2004,5(2),589-595.

Syn thesis of O-benzoyl-Chitosan and Its An tifungi Activity

FENG Yong-wei1,2, XIA Wen-shui＊1,2, SHEN Li-li1,2, ZHAO Yun-jie1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

This study ssing MeSO3H as catalyst and protecting agent to synthesize O-benzoylchitsan by esterification between chitosan and benzoyl chloride.The structure of the product was analyzed by FITR and1H-NM R spectroscopy.The esterification mainly occurred on OH group rather than-NH2group of chitosan.The average degree of substitution(DS)was 0.35.The antifungi activity of O-benzoyl-chitsan against the greymould,Botrytis cinerea was carried out.The result showed that the EC50of chitosan and O-benzoyl-chitosan were 1.55 mg m L-1and 0.27 mg m L-1,respectively.The anti-fungi activity of O-benzoyl-chitosan was much stronger than that of chitosan.

chitosan,O-benzoyl-chitosan,antifungi activity

S 482.2

A

1673-1689(2011)03-0367-04

2010-05-12

國家自然科學基金項目(20876068);國家863計劃項目(2007AA 100401);江蘇省科技成果轉化專項資金項目(BA 2009082)。

馮永巍(1980-),男,吉林長春人,博士研究生,主要從事功能性食品劑的研究。

Email:fywzyy@yahoo.com.cn

＊

夏文水(1958-),男,江蘇南京人,工學博士,教授,博士研究生導師。主要從事功能食品研究。Email xiaw s@jiangnan.edu.cn