松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇提取物體外抗氧化性試驗研究

黃俊麗, 張慜

(食品科學與技術國家重點試驗室江南大學 ,江蘇無錫 214122)

松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇提取物體外抗氧化性試驗研究

黃俊麗, 張慜＊

(食品科學與技術國家重點試驗室江南大學 ,江蘇無錫 214122)

采用超氧陰離子、羥基自由基、卵磷脂脂質體體系以及測定還原力的方法,研究了松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇3種食用菌,水提多糖、水提多酚、醇提多酚這3種不同提取方式,所得初提物的抗氧化試驗,并測定各種處理的可溶性多糖及多酚含量。結果表明:醇提多酚具有最強的還原力,其中黑牛肝菌還原力最強;3種食用菌醇提多酚的清除超氧陰離子的能力較其他兩種提取方式強;3種食用菌清除羥基自由基能力在醇提最大質量濃度下最強,分別達到59.00%、59.12%、57.19%,卵磷脂脂質體清除率分別達到:47.03%、37.84%、25.68%。

松茸;黑牛肝菌;雙孢白蘑菇;還原力;超氧陰離子;羥基自由基;卵磷脂脂質體

自古以來,作為食物或食物增香劑,食用菌就一直被廣泛使用。松茸是最有價值品種之一,不僅具有特殊的香味,也具有一些生理活性,如降低膽固醇、抗氧化性、免疫調節、抗腫瘤等作用[1]。黑牛肝菌數量大,商品價值最高,目前有關野生食用牛肝菌的研究主要集中在其營養成分分析和活性物質多糖的免疫及抗腫瘤作用方面,有關野生食用牛肝菌主要活性物質多糖組分的分離鑒定及抗氧化作用的研究還少見報道[2]。雙孢白蘑菇屬于高蛋白質、低熱量、低脂肪食物,還可以降低膽固醇、防止動脈血管硬化,對高血脂及糖尿病患者有一定的食療作用[3]。

多糖是生物有機體除蛋白質、核酸之外的第三大生物大分子。多糖作為信息分子廣泛參與細胞間配體與受體的相互識別、細胞內信號轉導等生理過程,與細胞活化、增殖、分化及產生細胞因子等有關。另外,多糖本身低毒、來源廣泛,使得多糖研究成為近年來的研究熱點[4]。多糖具有多種生物活性,某些多糖不但具有抗癌、抗病毒、抗衰老等作用,還是理想的免疫增強劑[5]。酚類化合物廣泛存在于植物食品中,由于其羥基取代的高反應性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性[6]。作者對3種食用菌冷凍干燥粉末,采用不同提取方式獲得初提物,并對各種處理進行抗氧化性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑牛肝菌、松茸:采自云南食用菌研究所基地,放冰塊于包裝溫箱中,當天空運到無錫;白蘑菇:無錫惠山區農林局提供,采后1 h內運送到試驗室;上述食用菌于70±2℃的烘箱中烘干。

鄰二氮菲,雙氧水,硫酸亞鐵,十二水磷酸氫二鈉,二水磷酸二氫鈉,三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,濃鹽酸,鄰苯三酚,鐵氰化鉀,三氯乙酸,氯化鐵,氯化鈉,對氨基苯磺酸,鹽酸萘乙二胺,亞硝酸鈉,卵磷脂,抗壞血酸:均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

臺式AO型氣流粉碎機:宜興清新粉體機械有限公司產品;冷凍水浴恒溫振蕩器:江蘇金壇億通電子有限公司產品;TDL-60臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;FA 1104型電子天平:上海天平儀器廠產品;恒溫水浴鍋:鄭州長城科工貿有限公司產品;超低溫冰箱U 410:New Brunswick Scientfic公司產品;Labconco凍干機:Labconco公司產品;721型紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司產品;UV-2100紫外可見分光光度計,農尼科(上海)儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

取3種不同食用菌,按1 g∶30 m L的比例加入蒸餾水于500 m L燒杯中,攪拌均勻,以保鮮膜封口,然后分進行水提和醇提,提取條件如下:

1.3.1 水提取多糖條件 90℃恒溫水浴鍋中,水提4 h[7]。

1.3.2 水提取多酚條件 100℃沸水浴中浸提30 min,然后4 000 g離心20 min,過濾,濾渣再反復提取2次,合并濾液;

1.3.3 醇提條件 以體積分數為80%的乙醇作提取液,料液比為1 g∶30 m L,在40℃下水浴浸提2 h,浸提次數為3次[8]。

將上述提取液,按一定體積比(50∶1∶1)提取液,220 g/L乙酸鋅溶液,106 g/L亞鐵氰化鉀溶液加入蛋白質沉淀劑,混勻,靜置30 m in后,離心去除蛋白質(4 000 r/m in,離心20 min)。取上清液濃縮至一定體積,加入3倍體積的體積分數95%乙醇,于冰箱內靜置過夜,4 000 r/min離心20min,棄上清液,沉淀用體積分數80%乙醇洗滌離心3次,將所得沉淀凍干后得到試驗所需提取物,用于試驗分析。試驗中處理號為:1～3為松茸3種提取方式所得粗提物,4～6為黑牛肝菌3種提取方式所得粗提物,7～9為白蘑菇3種提取方式所得粗提物,所有提取物經相應處理得到處理液。

1.4 檢測指標及測定方法

準確稱取凍干后0.1 g樣品,純水定容至100 m L,所得質量濃度為1 mg/m L,同樣方法配制0.2、0.4、0.6、0.8 mg/m L 的溶液,進行如下試驗。

1.4.1 還原力的測定 鐵氰化鉀還原法[9]:在2.5 m L pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的樣品液2.5 m L,質量分數1%的鐵氰化鉀溶液2.5 m L,混合物在50℃恒溫20 min后,再加入2.5 m L體積分數10%的三氯乙酸溶液,然后以3 000 r/min離心分離10 min,取上層清液5 mL加蒸餾水5 m L和質量分數0.1%FeCl3溶液1 mL,在700 nm處測定吸光度,吸光度越高,還原能力越強。

1.4.2 抑制超氧陰離子(O2-·)活性試驗 鄰苯三酚法[10]。鄰苯三酚在堿性條件下自氧化形成中間產物O2-·,此自由基能促進鄰苯三酚的自氧化,因此通過測定某物質對鄰苯三酚自氧化的抑制作用,即可表征其對O2-·的清除作用。

取10支10 mL試管,各加入0.05 mol/L TrisHCL緩沖液 4.5 m L,置于 25℃水浴中預熱20min,分別加入1 mL不同濃度溶液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻后于25℃水浴中反應4 min后,立即加入兩滴8 mol/L HCl終止反應,320 nm處測定吸光度(Ai),空白對照組以相同體積的蒸餾水代替。清除率計算公式為:

式中:A1和A2分別為體系不加 H2O2和加 H2O2時的吸光度,A3為加入多糖溶液后的吸光度。

1.4.4 在卵磷脂脂質體中抗氧化活性的測定 試劑的配置[11]:制備脂質體 PBS分散體系(LLS),30 mg卵磷脂溶解于 30 m L 10 mmol/L pH7.4的PBS中,冰浴震蕩。制成三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液:15 g TCA,0.37 g TBA,2.1 m L濃鹽酸依此加入100 mL水中。

測定步驟:樣品管中依此加入1 m L卵磷脂、1 m l 40μmol/L三氯化鐵溶液(FeCl3)、1 mL 400 μmol/L抗壞血酸和1 m L樣品,混勻。避光于37℃水浴60 min,再加入2 m L TCA-TBA-HCI混合液,100 ℃水浴15 m in,迅速冷卻,以5 500 r/min轉速離心20 min,取上清液在532 nm測吸光值A s,空白管以1 m L重蒸水代替1 mL樣品,操作方法同樣品管,可測得空白管的吸光度Ac。

式中:A0為空白液的吸光值;A1為待測樣品的吸光值。

1.4.3 清除羥自由基(·OH)活性試驗 Fenton反應[10]。利用 H2O2與 Fe2+混合產生 ·OH,鄰二氮菲-Fe2+水溶液經·OH氧化為鄰二氮菲-Fe3+后,其最大吸收峰消失,然后測定其吸光度的變化。

取8支10 mL比色管,均依次加入1 mL pH 8.20的 Tris-HCL溶液、0.3 m L 7.5 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液和0.3 m L 7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液,1號為空白,3～7號分別加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 m L 1 mg/mL樣品溶液,8號加入1 m L 0.2 mg/m L的VC溶液,最后往2～8號分別加入1 m L 7.5 mmol/L H2O2溶液,定容至刻度。在37 ℃水浴中反應1 h,在510 nm下測吸光度A,計算對·OH的清除率。

式中:Ac為空白液的吸光值;As為待測樣品的吸光值。

1.4.5 總酚含量的測定 福林酚試劑法[12]。取1.0 mL樣品提取液,依次加入5.0 m L水、1 mL福林酚顯色劑和3 m L質量分數7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,顯色2 h,在765 nm波長下測定吸光度。每組試驗重復3次。

1.4.6 總糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定。吸取1 mL樣品液,1 m L質量分數5%苯酚加入5 m L濃硫酸的試管搖勻,10 m in后,放入30℃水浴中20 min,以空白試劑調零,在490 nm波長比色,由標準曲線計算含量。每組試驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 還原力的測定

3種食用菌不同提取方式所得提取物還原力結果測定如圖1。處理號1～3為松茸冷凍干燥粉末的結果,提取方式依次為90℃水4 h提取、100℃水0.5 h提取、40℃體積分數80%乙醇提取。處理號4～6為黑牛肝菌測定結果,7～9為白蘑菇測定結果。還原能力是表示抗氧化物質提供電子能力的重要指標,抗氧化物質通過提供電子可使自由基變成穩定的分子,從而失去活性。許多研究證實抗氧化活性同還原力是密切相關的[13]。

由圖1可以清晰看出3種食用菌提取方式3所得初提物還原力相對其他兩種提取方式較高,同時相同質量濃度下,黑牛肝菌還原力最強,在低濃度下,松茸較雙孢白蘑菇還原力強,高濃度下,還原力基本一致。雙孢白蘑菇還原力在3種食用菌中,還原力最低,表現在同等提取及測定操作條件下,處理號7第一個數值與處理號8第一至3個數值均測不出來,即雙孢白蘑菇提取方式1、2所得的低質量濃度樣液中,無法測定還原力大小。同一組試驗結果中,還原力隨著其質量濃度的增大而增強。

圖1 3種食用菌粉末不同提取物還原力測定Fig.1 Reducing power of extracts from the three edible mushrooms’powders

2.2 清除超氧陰離子(O-2·)活性的測定

生物體內氧化還原反應中,大致有2%～5%的氧會產生超氧自由基,超氧自由基的毒性是機體發生氧中毒的主要原因,表現在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用,進而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失活、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化[14]。其在3種食用菌不同提取方式所得提取物結果測定如圖2。清除超氧陰離子試驗結果中,提取方式并不是最明顯影響因素,但提取方式3所得結果依舊占據超氧陰離子清除率優勢。而3種食用菌清除超氧陰離子強弱的順序為黑牛肝菌、雙孢白蘑菇、松茸,與還原力中結果黑牛肝菌、松茸、雙孢白蘑菇略為不同。同一組試驗結果中,清除超氧陰離子能力隨著其質量濃度的增大而增強。

圖2 3種食用菌粉末不同提取物超氧陰離子清除率的測定Fig.2 Superoxide anion scavenging activity of extracts from the three edible mushrooms’powders

2.3 清除羥自由基(·OH)活性的測定

羥自由基(·OH)清除率是反映物質抗氧化作用的重要指標。·OH在其氧原子上含有一個未配對電子,奪取電子的能力很強,是體內最活潑的活性氧,可介導許多病理變化。3種食用菌不同提取方式所得提取物清除羥自由基結果測定如圖3。此組試驗結果中,清除羥自由基能力強弱與提取方式沒有還原力以及清除超氧陰離子中明顯呈規律,在同一種食用菌內不同,3種食用菌間也不同,即無法整體判斷提取方式的優劣,也無法整體判斷哪種食用菌在清除羥自由基方面的優劣。3種食用菌均在提取方式3下初提物質量濃度1.0 m g/m L時,清除羥自由基能力最大,依次為 59.00%、59.12%、57.19%,較其對應超氧陰離子清除率 12.79%、15.97%、13.20%大,說明各食用菌清除羥自由基強于清除超氧陰離子的能力。同一組試驗結果中,清除羥自由基(·OH)能力隨著其濃度的增大而增強。

圖3 3種食用菌粉末不同提取物羥基自由基清除率的測定Fig.3 Hydrogen peroxide scavenging activity of extracts from the three edible mushrooms’powders

2.4 在卵磷脂脂質體中抗氧化活性的測定

卵磷脂C-2位上所含極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的過不飽和脂肪酸,在亞鐵離子的催化下,經振蕩能誘發脂質過氧化產生烷氧基(LO·)和烷基過氧基(LOO·)。在加熱的條件下,過氧化物可與硫代巴比妥酸(TBA)反應產生紅色化合物,并在波長532 nm處有顯著的光吸收[13]。試驗利用這種原理,研究3種食用菌不同提取方式所得提取物清除卵磷脂脂質體結果測定如圖4。

圖4 3種食用菌粉末不同提取物卵磷脂脂質體清除率的測定Fig.4 Lecithin liposomes scavenging activity of extracts from the three edible mushrooms’powders

松茸和雙孢白蘑菇清除卵磷脂脂質體的變化規律相似,根據提取方式有較為明顯的強弱變化:提取方式1、提取方式2、提取方式3,松茸乙醇提取的0.2 mg/m L數值0.27,很小,在圖中顯示最低,其水提方式1的1.0 mg/m L質量濃度數值結果為47.03%,最大。而黑牛肝菌清除率的強弱變化規律為:提取方式3、提取方式1、提取方式2,即松茸、雙孢白蘑菇水提方式優于乙醇提取效果。其各種食用菌最大結果間強弱比較:松茸水提多糖1.0 mg/mL為47.03%、雙孢白蘑菇水提多糖1.0 mg/m L為37.84%、黑牛肝菌醇提多酚1.0 m g/m L為25.68%。同一組試驗結果中,清除卵磷脂脂質體能力隨著其質量濃度的增大而增強。

2.5 總酚與總糖質量分數的測定

目前,很多研究多糖、多酚的抗氧化性,如陳金娥等人研究紅茶、綠茶、烏龍茶活性成分抗氧化性,其中:醇提得到各種茶多酚提取液,水提得到各種茶多糖提取液[15]。作者試驗中測得3種食用菌不同提取方式所得提取物中可溶性多糖、多酚含量如圖5。圖5顯示的結果與這一結論基本相似:水提多糖質量分數高,醇提多酚質量濃度高,即處理1、4、7多糖質量分數與處理3、6、9多酚質量濃度很明顯。處理5、9多糖質量分數很低,顯示偏低。每種食用菌內,3種處理方式所得初提物多酚質量濃度依次增加,而多糖質量分數變化趨勢不甚明顯。

3 結 語

圖5 3種食用菌粉末不同提取物可溶性總糖和總酚的測定Fig.5 Content of of the solube total sugar content and total phenolic compounds of extracts from the three edible mushroom s’powders

1)本試驗采用3種體系以及通過測定還原力的方法,研究了松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇3種食用菌,水提多糖、水提多酚、醇提多酚這3種提取方式,測定所得初提物的抗氧化試驗。結果表明醇提多酚具有最強的還原力,其中黑牛肝菌還原力最強。

2)清除超氧陰離子的能力結果顯示3種食用菌醇提多酚的較其他兩種提取方式強。

3)清除羥基自由基能力在醇提最大質量濃度下最強。

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Study on the Antioxidant Activities of Tricholomam atsutake Sing.,Boletus aereus and Agaricus bisporus

HUANG Jun-li, ZHANG Min＊
(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this manuscript,the antioxidation activities of three extractions of Pine-mushroom(Tricholoma matsutakeSing.)powers,Boletus aereuspowers andA garicus bisporuspowers were evaluated by the hydroxyl radical system,superoxide radical system,reducing power,and lecithin liposome system.The results showed that alcohol extract polyphenols special for Boletus aereus exhibited the strongest reducing power.Among of three extraction processes,the alcohol extracted process demonstrated the highest superoxide anion scavenging activity.the Hydrogen peroxide scavenging activity of three kinds of edible mushroom s in the alcohol extracting are strongest,respectively 59.00%,59.12%and 57.19%;For theLecithin liposomes scavenging activity,1.0 mg/mL Pine-mushroom (water) ,Agaricus bisporus(water),Boletus aereus(alcohol)w ere achieved at 47.03%,37.84%,25.68%,respectively.

pine-mushroom(Tricholom amatsutakeSing.),Boletus aereus,A garicus bisporus reducing pow er,superoxide anion scavenging activity,hydrogen peroxide scavenging activity,lecithin liposomes scavenging activity

＊

張慜(1962-),男,浙江平湖人,工學博士,教授,博士研究生導師,主要從事農副產品加工與貯藏研究。Email:min@jiangnan.edu.cn。

S 567.3

A

1673-1689(2011)01-0342-06

2010-01-25

國家“十一五”科技支撐計劃重點項目(2008BADA 1B05)。