銅綠假單胞菌注射液與5-Fu腹腔化療對大鼠結腸吻合口愈合影響的對比研究

高成生，董哲，李海玲，祁永利，鄭鵬飛

(1．遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 121001;2．萊蕪市羊里醫院普外科，山東 萊蕪 271100)

腹腔化療(intraperitoneal chemotherapy，IPC)屬于高選擇性的區域化療，雖然能在一定程度上可防止腫瘤的復發和轉移，但在臨床應用中常出現并發癥，尤其是影響術后腸吻合口的愈合，嚴重時可導致吻合口漏。銅綠假單胞菌(PA)注射液是一種由生物工程技術制備的新型菌類制劑，屬于非特異性免疫激活物，主要用于惡性腫瘤的輔助治療。十余年的臨床應用證明，PA注射液不但能防止腫瘤的術后復發和轉移，還能激活機體的體液免疫和細胞免疫，誘導跨菌屬抗體的產生，有效地預防術后感染的發生。相對于傳統的腹腔化療藥物，PA注射液特有的免疫調節和直接殺傷作用使其有望成為腸道腫瘤術后理想的輔助用藥。本研究以大鼠結腸吻合模型作為研究對象，比較圍手術期使用PA注射液與5-Fu術中腹腔化療對大鼠結腸吻合口愈合的影響，為PA注射液進一步的臨床應用以及腸道腫瘤術后輔助用藥的選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物及分組

健康SD大鼠40只，體重230～270 g，雌雄不限，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。隨機分為4組:模型對照組、PA注射液皮下注射組(PA皮下注射組)、PA注射液皮下注射+術中腹腔噴灑組(皮下注射+腹腔噴灑組)、5-Fu腹腔化療組(5-Fu組)，每組10只。PA皮下注射組和PA皮下注射+腹腔噴灑組大鼠于術前3 d開始皮下注射PA注射液(北京萬特爾生物制藥有限公司生產)，每次0．5 ml，隔日1次，至術后7 d;PA皮下注射+腹腔噴灑組同時術中腹腔噴灑PA注射液0．5 ml;5-Fu組術中腹腔應用5-Fu(20 mg·kg－1)。

1． 2 大鼠結腸吻合模型

術前大鼠禁食12 h，以10%水合氯醛(3 mg·kg－1)腹腔麻醉，于劍突下1 cm處取腹正中切口，長約3 cm。逐層切開入腹腔，距盲腸端3 cm處切除1 cm結腸，6-0無損傷線間斷內翻縫合8～10針，1號絲線分層縫合腹部切口，術后12 h后自由進食飲水。

1． 3 觀察指標及方法

1．3．1 腹腔粘連情況 術后7 d頸部脫臼處死各組大鼠，分別觀察腹部粘連情況。

1．3．2 吻合口破裂壓(ABP) 距吻合口近、遠端各3 cm切斷腸袢，置于恒溫臺氏液中，腸袢一端與微量輸液泵連接，另一端與壓力換能器連接。用輸液泵向腸管內注入亞甲藍溶液(3 ml·min－1)，將觀察到有亞甲藍溢出或壓力突然下降時的數值記為破裂壓。

1．3．3 吻合口組織HE染色、Masson染色及電鏡觀察 取吻合口處腸袢，置于10%中性甲醛液內固定，常規石蠟包埋，切片層厚4 μm，行HE染色，光鏡下觀察吻合口上皮移行情況及吻合口瘢痕中巨噬細胞和成纖維細胞等炎性細胞的分布狀況。常規Masson染色，觀察吻合口組織中膠原纖維的分布情況，膠原纖維被苯胺藍染成藍色，肌纖維被酸性品紅染成紅色。吻合口組織用3%戊二醛固定液預固定，1%鋨酸固定液復固定，丙酮系列脫水，環氧樹脂EP0N812包埋，半薄切片，光鏡定位，Relehert超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，JEM-120透射電鏡觀察黏膜下淋巴的形態及內皮細胞的超微結構。

1．3．4 吻合口組織轉化生長因子(TGF-β)和纖維連接蛋白(FN)的表達 將吻合口組織病理標本以石蠟包埋，切片厚度為5 μm，按S-P法進行免疫組織化學染色。所用試劑均由北京博奧森生物技術有限公司提供。評定標準:TGF-β和FN均以細胞胞質和(或)細胞膜出現黃色或棕黃色顆粒者為陽性細胞，在高倍鏡下(×400)各隨機選取5個視野，分別計數陽性細胞數的平均值半定量分析。

1． 4 統計學處理

2 結 果

術后模型對照組大鼠死亡1只，5-Fu組死亡3只，解剖均發現吻合口漏。

2． 1 腹部粘連情況

術后7 d，解剖大鼠觀察腹部粘連情況，結果顯示，PA皮下注射組和PA皮下注射+腹腔噴灑組大鼠的腹部粘連情況均比較輕微，與模型對照組大鼠相近;而5-Fu組大鼠腹部臟器粘連現象非常明顯，而且腸管由于慢性梗阻而明顯變粗(圖1)。

圖1 術后7 d各組大鼠腹部粘連情況Fig 1 The level of visceral adhesions afer 7 days

2． 2 吻合口破裂壓

術后7 d PA皮下注射組和PA皮下注射+腹腔噴灑組之間腸吻合口破裂壓無差異(P＞0．05)，但顯著高于模型對照組和5-Fu組(P＜0．01)，說明PA注射液對腸吻合口的愈合有一定的促進作用。5-Fu組大鼠破裂壓最低，顯著低于模型對照組(P＜0．01)，說明化療藥物5-Fu對腸吻合口組織愈合有嚴重影響。

表1 各組吻合口破裂壓Tab 1 Anastomotic bursting pressure ineach group

2． 3 病理學及電鏡觀察結果

吻合口組織HE染色(圖2)顯示，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組大鼠的腸吻合口組織中中性粒細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等炎性細胞明顯增多，細胞核增大、濃染，且胞漿豐富，黏膜上皮移行，肉芽組織毛細血管豐富，可見大量腺體結構。5-Fu組大鼠吻合口組織中炎性細胞較少，且有黏膜破壞。電鏡下觀察(圖3)顯示，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組大鼠吻合口組織黏膜的杯狀上皮細胞及黏膜下的淋巴細胞的細胞核明顯增大、色深，線粒體等細胞器增多。

圖2 大鼠結腸吻合口組織HE染色 ×200Fig 2 The HE stain of anastomosis ×200

圖3 電鏡下觀察結果Fig 3 The observation through electron microscope

2． 4 Masson 三色染色

大鼠結腸吻合口組織Masson染色(圖4)顯示，術后7 d，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組大鼠吻合口膠原纖維面積和密度明顯增大，分布較有規律;5-Fu組膠原纖維面積明顯減少，分布比較紊亂。

圖4 大鼠結腸吻合口組織Masson染色 ×200Fig 4 The Masson stain of anastomosis ×200

2． 5 吻合口組織TGF-β和FN的表達

術后7 d，大鼠結腸吻合口組織TGF-β和FN的檢測結果顯示，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組之間TGF-β和FN的表達無差異(P＞0．05)，均高于模型對照組(P＜0．05)和5-Fu組(P＜0．01)。5-Fu組的TGF-β和FN的表達量最低，顯著低于模型對照組(P ＜0．05)(表2)。

表2 吻合口組織TGF-β和FN %Table 2 Expression of anastomotic TGF-β、FN(x±s) %

表2 吻合口組織TGF-β和FN %Table 2 Expression of anastomotic TGF-β、FN(x±s) %

與 5-Fu組比較，a P＜0．01;與模型對照組比較b P＜0．05

組 別 n TGF-β 9 25．02 ±2．07 29．82 ±3．03 PA 皮下注射組 10 26．96 ±1．55ab 32．80 ±3．27ab PA皮下注射+ 腹腔噴灑組 10 27．40 ±1．85ab 33．32 ±3．32ab 5-Fu 組 7 22．74 ±1．63b 26．14 ±2．28 FN模型對照組b

免疫組織化學染色(圖6)顯示，TGF-β主要表達于巨噬細胞、成纖維細胞等，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組TGF-β表達相對較多，而5-Fu組的表達量明顯較少(圖5)。FN主要表達于各類增殖細胞，PA皮下注射組和PA皮下注射+術中腹腔噴灑組FN表達明顯較多，巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等最明顯，而5-Fu組FN表達也相對較少。

圖5 大鼠腸吻合口組織中TGF-β的表達 ×200Fig 5 Expression of anastomotic TGF-β ×200

圖6 大鼠腸吻合口組織中FN的表達 ×200Fig 6 Expression of anastomotic FN ×200

3 討 論

創傷的修復和愈合是一個多因素參與的復雜過程。本研究發現，PA注射液對腸吻合口愈合的影響也是通過多方面的作用實現的。PA注射液屬于非特異性免疫激活劑，具有激活補體、促進調理吞噬及調節炎癥反應等功能，可激活巨噬細胞和T淋巴細胞等，調節免疫平衡、促進膠原及各種細胞因子的分泌。PA注射液激活機體的免疫系統后，明顯地降低了術后感染的發生率，本身就降低了感染對傷口愈合的抑制，在一定程度上促進了愈合［1］。

Mossman等［2］研究表明，Ⅰ型菌毛可特異性激活細胞表面的Toll樣受體，同樣研究［3］顯示，腸道黏膜表面，黏膜固有層的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞，黏膜下層的動靜脈、縱形和環形肌層等處均有Toll樣受體的表達。提示PA注射液中所含的Ⅰ型菌毛也能與血管內皮細胞和黏膜上皮細胞的Toll樣受體結合，從而通過激活血管內皮細胞、黏膜上皮等促進血管增生及上皮的增殖移行。我們在光鏡下可以看到，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組吻合口組織中炎性細胞較多，血管豐富，黏膜上皮較完整，而5-Fu組則相對較少，黏膜上皮有破壞現象。電鏡下顯示，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組吻合口組織中黏膜上皮的杯狀細胞核明顯增大、增深，線粒體增多，說明細胞被激活后染色質增多，增殖旺盛。

另外，激活巨噬細胞和T淋巴細胞等免疫細胞，不僅提高了機體的免疫功能，對創傷的修復過程起著非常關鍵的作用［4－5］。巨噬細胞和T淋巴細胞等免疫細胞表面也有Toll樣受體，也可被PA注射液的Ⅰ型菌毛特異性激活。巨噬細胞被激活后，產生TGF-β、VEGF和PDGF等細胞因子以及FN等的功能也必然增強。本研究中，PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組術后7 d TGF-β和FN的表達明顯升高;Masson染色顯示吻合口的膠原也增多，而且分布也更加規律;吻合口的破裂壓也相應增高。

TGF-β是一種多功能生長因子，主要由巨噬細胞和成纖維細胞等分泌，反過來又進一步增強巨噬細胞和成纖維細胞的活性，促進成纖維細胞的增殖移行，還可調節膠原的沉積［6］。Migaly等［7］研究發現，結腸吻合術后皮下導管注射腺病毒攜帶的TGF-β1，能夠增加吻合口破裂壓，并促進結腸的愈合。FN是存在于細胞表面、細胞外液、結締組織和大多數基底膜中的一組結構類似、免疫原性相同的糖蛋白，主要由增殖細胞合成，存在于巨噬細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等的表面，是連接細胞與細胞外纖維和基質的介質。手術后，FN可增加血小板在吻合口的附著，促進吞噬細胞、纖維母細胞、內皮細胞和表皮細胞黏附、遷移及增生，參與吻合口早期和中期組織的修復和愈合［8］。

一方面，TGF-β和FN由激活的巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞等增殖細胞合成，另一方面，TGF-β和FN又反過來激活這些細胞的活性，形成一個復雜機制。而5-FU作為常用的化療用藥，抑制DNA和RNA的合成，不僅降低了機體的免疫力，也抑制巨噬細胞和T淋巴細胞等免疫細胞的活性，抑制TGF-β等細胞生長因子的合成和分泌，阻礙了傷口的愈合。因此，在本研究中，5-FU組術后7 d組織炎性細胞明顯減少，TGF-β和FN的表達也伴隨減少，導致黏膜的壞死，膠原沉積的減少、分布不均勻及吻合口破裂壓的降低。這也是實驗中PA皮下注射組和皮下注射+腹腔噴灑組腹腔粘連無加重，而5-FU組卻粘連卻較重的原因。PA注射液能從總體上提高機體免疫水平，伴隨各種細胞因子增加，如 TGF-β［9］，一方面 TGF-β1 促進愈合，能增加瘢痕生成，另一方面TGF-β3則能下調TGF-β1抵抗瘢痕形成;此外，巨噬細胞分泌的PDGF［10］等也能促進愈合并降低瘢痕生成，減少粘連的發生。但具體的作用機制還有待于進一步的研究。

綜上所述，PA注射液可提高機體的免疫狀態，增加吻合口炎性細胞數量，從多方面促進吻合口的早期愈合，降低吻合口漏的發生，而且不會加重粘連程度。

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