雌激素受體α基因PvuⅡ和XbaⅠ多態性與子癇前期相關性研究

湯琳琳，徐友娣，薛鑫源，韓云

(南京醫科大學附屬南京第一醫院婦產科，江蘇南京 210006)

子癇前期(preeclampsia，PE)是危及母嬰健康的妊娠期特發性疾病，其發病機制至今尚未闡明。血管內皮損傷是目前公認的PE一系列病理生理反應的基礎。而雌激素為天然的血管保護劑，能改善內皮細胞功能，抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移，降低血脂，改善血流動力學參數，起到擴血管、抗炎、抗增生等血管保護作用［1］。在人體內，雌激素通過與其特異性受體——雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合來調節一系列基因的表達，進而發揮其重要生理作用。研究已發現，ER基因多態性與冠心病密切相關［2］，而 PE亦有血管內皮損傷這一基本過程，因此提出，ER基因多態性與PE具有密切的關系。既往ER的研究大部分集中在 ERα的遺傳多態性方面［2－3］，本研究亦選擇ERα基因。通過從全血中提取DNA，運用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測PE患者與健康孕婦在ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ兩個酶切位點的多態性，探討PE的發生與ER基因多態性之間的關系及不同病變程度的PE與其多態性之間的關系，為今后進一步研究PE的發病機制奠定基礎，也為今后臨床上的早期診斷、干預性治療和尋找藥物作用靶點闡明理由。

1 資料與方法

1． 1 臨床資料

按文獻［4］標準，選取2008年7月至2010年2月在我院產科住院的135例診斷為PE的患者為研究對象(PE組)，組內進一步分為輕度PE組(n=64)和重度PE組(n=71);選取同期住院的122例年齡、孕周與實驗組均無統計學差異的正常孕婦為對照組。所有孕婦均為初產婦，無其他合并癥和慢性病史，研究對象符合Hardy-Weinbery平衡定律。

1． 2 研究方法

1．2．1 DNA提取 取全血3 ml，選用美國OMEGA公司提供的全血DNA試劑盒，提取基因組DNA后，置－80℃保存備用。

1．2．2 PCR檢測 限制性內切酶 PvuⅡ和 XbaⅠ酶切位點相近，XbaⅠ與P位點相距50 bp。本實驗ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠPCR擴增產物為同一段包括第1內含子和部分第2外顯子，長度1．3 kb的DNA片斷。PCR引物設計如下:上游引物序列為5'-CTGCCACCCT ATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3'，下游引物序列為5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。總反應體系50 μl，組成如下:PCR Master Mix(2 × )25 μl，上游引物 1．0 μl，下游引物 1．0 μl，模板 DNA 3．0 μl，滅菌水20 μl。混勻后按下列循環擴增:94℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 90 s，72 ℃保溫延伸10 min，共35個循環。取PCR產物10 μl在1．5%瓊脂糖凝膠上電泳35 min，經溴化乙錠染色及凝膠系統成像后觀察特異性條帶，為1 300 bp。

1．2．3 RFLP檢測 ERα基因PCR產物分別與限制性內切酶PvuⅡ及XbaⅠ混合，水浴37℃過夜。成分如下:PCR 產物 10 μl，PvuⅡ或 XbaⅠ1．0 μl，10 × buffer G 2．0 μl，滅菌雙蒸餾水 17 μl。取各自酶切產物行經溴化乙錠染色的1．5%瓊脂糖凝膠電泳。

ERα基因的PCR擴增產物為1．3 kb，經PvuⅡ限制酶水解后可得到3種基因型(含PvuⅡ酶切位點的等位基因記為“p”，無酶切位點的記為“P”)，即pp型(850 bp+450 bp)、Pp型(1 300 bp+850 bp+450 bp)、PP型(1 300 bp)。同樣，ERα基因的PCR擴增產物經XbaⅠ限制性內切酶水解后可得到3種基因型:xx型(900 bp+400 bp);Xx型(1300 bp+900 bp+400 bp);XX型(1300 bp)。

1． 3 統計學處理

研究數據均采用SPSS 13．0統計軟件進行分析，基因型和等位基因頻率采用基因計數法計算，基本資料以x±s表示，采用t檢驗，兩組基因型分布頻率及等位基因表型頻率的比較，采用R×C列聯表和四格表χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2． 1 臨床資料比較

見表1。

表1 PE組及對照組的基本資料

PE組和對照組之間及PE組組內孕婦年齡、孕周比較差異無統計學意義。PE組與對照組之間的收縮壓和舒張壓均差異有統計學意義(P＜0．05)，PE組內輕度PE收縮壓、舒張壓及24 h尿蛋白顯著低于重度PE(P ＜0．05)。

2． 2 ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ酶切結果

見圖1。

圖1 ER α基因多態性PvuⅡ及XbaⅠ酶切電泳圖

2． 3 PE組與對照組ERα-PvuⅡ的基因多態性

見表2、3。

由表2可見，PE組與對照組之間ERα-PvuⅡ基因型頻率分布差異無統計學意義(χ2=5．117，P=0．077)，而等位基因頻率分布差異有統計學意義(χ2=4．756，P=0．029)。由表3 可見，PE 組組內輕度PE與重度PE的ERα-PvuⅡ基因型及等位基因頻率差異均無統計學意義(χ2=1．644，P=0．440;χ2=0．442，P=0．506)。

2． 4 PE組與對照組ERα-XbaⅠ的基因多態性

見表4、5。

由表4、5可見，PE組與對照組之間及輕度PE與重度PE的ERα-XbaⅠ基因型及等位基因頻率分布差異均無統計學意義(P＞0．05)。

3 討 論

國內外關于ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ多態性與妊娠期高血壓或PE關系的研究結果各一。早期向若蘭等［5］研究發現，妊娠期高血壓疾病組PP基因頻率、P等位基因頻率明顯高于對照組(P＜0．01);妊娠期高血壓疾病組與其對照組X和x等位基因頻率分布差異有統計學意義(P＜0．01)。ER的PvuⅡ及XbaⅠ基因多態性與妊娠期高血壓疾病相關，二者都是其發病的獨立危險因素，PvuⅡ基因多態性與妊高征的相關程度較強，XbaⅠ基因多態性與妊娠期高血壓疾病的相關程度較弱。德國Tempfer等［6］的一個小樣本多基因病例對照研究結果表明，ERα基因PvuⅡ多態性并非重度PE的獨立危險因素，但可能參與構成重度PE的多基因發病機制。Molvarec等［7］研究發現，重度PE與雌激素受體α基因PvuⅡ及XbaⅠ的多態性均無相關性。Zhang等［8］研究結果亦表明，PE組與對照組之間雌激素受體α基因PvuⅡ或者XbaⅠ在基因型和等位基因頻率分布之間無明顯相關性，且輕度PE和重度PE之間亦無明顯相關性。

表2 PE組與對照組ERα-PvuⅡ的基因多態性統計結果

表3 PE組內ERα-PvuⅡ的基因多態性統計結果

表4 PE組與對照組ERα-XbaⅠ的基因多態性統計結果

表5 輕度PE與重度PE組間的ERα-XbaⅠ基因多態性統計結果

本研究通過對南京地區135例的PE患者(其中64例為輕度，71例為重度)與122例正常孕婦進行研究，發現ERα基因PvuⅡ酶切位點多態性與PE的發生存在一定的相關性，P等位基因可能是其危險因素，但與PE的病變程度無明顯關聯。ERα基因XbaⅠ酶切位點的基因多態性與PE的發生及其病變程度均無明顯相關。

雌激素必須與靶組織細胞漿或核內ER結合才能發揮作用。因此，雌激素受體的結構和功能直接影響到雌激素的作用效果。根據本研究結果，推測ERα基因P等位基因的出現改變了ERα的表型，從而降低了雌激素與其結合后的效用，故血管內皮易受損傷，易致PE的發生。而PE的病變程度則由其他因素決定，如血管活性物質等。

ERα基因多態性與PE相關性的研究結果目前國內外有較大的差異，甚至完全相反。考慮可能與人群、種族、地域或樣本量有關，也可能某些基因雖未發生突變，但其基因活性的改變與發病相關，同時PE是一種多因素疾病，屬遺傳易感性疾病，是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。探求PE的發病原因以及將研究成果應用于臨床以篩選PE高危人群，需要更大規模的、多方面的、多地域的、多民族的流行病學和進一步的實驗室研究。

［1］GRUBER C J，TSCHUGGUEL W，SCHNEEBERGER C，et al．Production and actions of estrogens［J］．N Engl J Med，2002，346(5):340-352．

［2］金莉子，肖宏凱，陳劍，等．雌激素受體α基因多態性與冠心病病變程度的關系［J］．中國動脈硬化雜志，2008，16(8):647-650．

［3］van DIJK M A，FLOORE A N，KLOPPENBORG K I，et al．A functional assay in yeast for the human estrogen receptor displays wild-type and variant estrogen receptor messenger RNAs present in breast carcinoma［J］．Cancer Res，1997，57(16):3478-3485．

［4］樂杰．婦產科學［M］．6版．北京:人民衛生出版社，2006:97．

［5］向若蘭，王琳，王毅，等．妊娠高血壓綜合征和雌激素受體基因血管緊張素轉化酶基因相關性研究［J］．當代醫學，2001，7(11):78-82．

［6］TEMPFER C B，JIRECEK S，RIENER E K，et al．Polymorphisms of thrombophilic and vasoactive genes and severe preeclampsia:a pilot study［J］．J Soc Gynecol Investig，2004，11(4):227-231．

［7］MOLVAREC A，VéR A，FEKETE A，et al．Association between estrogen receptor alpha(ESR1)gene polymorphisms and severe preeclampsia［J］．Hypertens Res，2007，30(3):205-211．

［8］ZHANG J，BAI H，LIU X，et al．Genotype distribution of estrogen receptor a polymorphisms in pregnant women from healthy and preeclampsia populations and its relation to blood pressure levels［J］．Clin Chem Lab Med，2009，47(4):391-397．