新型環糊精衍生物HPn-SBEm-β-CD動物血管給藥的生物效應評價

王暉，陳乘，周成梁，余書勤

(南京師范大學生命科學學院，江蘇省醫藥超分子材料及應用重點實驗室，江蘇南京 210046)

環糊精(cyclodextrin，CD)系淀粉經環糊精葡聚糖轉位酶酶解環合后得到的由6～15個葡萄糖分子連接而成的環狀低聚糖天然產物［1－3］，常見的有 α -、β -和γ-CD，使用最為廣泛的是β-CD。但由于其溶解度小、溶血作用強、非腸道給藥不僅刺激性強還具有明顯的腎毒性，因此，只適合口服而不能用于非腸道給藥［4］。為了克服天然β-CD環糊精的缺點，一系列β-CD環糊精衍生物被合成。作為藥用輔料，環糊精衍生物(CDD)具有增加藥物的溶解度及穩定性、提高藥物的生物利用度、控制藥物的釋放速率等優點，應用越來越廣泛，其中2個重要的衍生物分別是羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)和磺丁基醚-β-環糊精(SBE-β-CD)［5］，二者均具有水溶性好、腎毒性低、溶血作用小及局部刺激性輕微等特點。

本實驗室新合成的環糊精衍生物HPn-SBEm-β-CD是以羥丙基和磺丁基混合取代的環糊精衍生物，研究人員期望其在理化性質、性能和安全性方面均優于HP-β-CD和SBE-β-CD。已有實驗證明，其溶解性好，包合藥物能力較強，有極好的應用前景，但安全性值得關注。本實驗主要研究HPn-SBEm-β-CD經血管給藥后對紅細胞的毒性和對動物的神經精神系統、心血管和呼吸系統的影響。

1 材料與方法

1． 1 材料

1．1．1 實驗動物 (1)昆明種小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由東南大學醫學院實驗動物中心提供，飼養溫度22～26℃，小鼠飼養3 d后使用。(2)Beagle犬由蘇州西山中科實驗動物有限公司提供。(3)健康新西蘭大白兔由東南大學醫學院實驗動物中心提供，體重約2．0 kg。實驗前對所有動物稱重并觀察進食量、一般行為表現以確認受試動物健康。

1．1．2 藥物與試劑 不同取代度的 HPn-SBEm-β-CD由江蘇省醫藥超分子材料與應用重點實驗室合成;鹽酸氯丙嗪注射液(北京永康制藥廠);β-CD、SBE7-β-CD(TCI，日本);HP-β -CD、M-β -CD(南京德寶生化器材有限公司);戊巴比妥鈉(上海化學試劑公司分裝)，戊二醛溶液(Sigma，美國)，其余試劑均為國產分析純。

1．1．3 儀器 低溫離心機(Centrifuge 5417R型，德國Eppendorf)，掃描電子顯微鏡(JSM-5610LV型，日本電子公司)，離心沉淀機(LDZ5-2型，北京醫用離心機廠)，可見紫外分光光度計(UV-2450，日本島津)，恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，六光道SYS-I型小鼠自發活動測定儀(自制)，RM-6000型多導生理記錄儀(日本光電);WDT-204型自動平衡記錄儀(上海大華儀表廠)。

1． 2 方法

1．2．1 HPn-SBEm-β-CD 的溶血試驗［6］取新鮮兔血10 ml置于潔凈三角瓶中，玻璃棒攪拌10 min去除纖維，加入約20倍生理鹽水置于離心機中，以1500 r·min－1離心3 min，除去上清液，如此反復洗滌直到上清液澄清為止。將制備的紅細胞以生理鹽水配制成5%(V/V)懸浮液。

由于 β-CD溶解度差，故濃度梯度設為1、6、12 mmol·L－1，而11 種不同取代度的 HPn-SBEm-β -CD、HP-β -CD、SBE7-β -CD 濃度梯度設為1、6、12、25、35 mmol·L－1，紅細胞與各種環糊精在37℃下振搖作用 30 min，冷卻，以 2 500 r·min－1離心 5 min，取上清液于λ=543 nm處測定紫外吸收值，溶血百分率的計算公式如下:溶血百分率=(A受試物－A陰性對照)/A陽性對照×100%

1．2．2 掃描電鏡觀察HPn-SBEm-β-CD對紅細胞形態的影響 觀察方法參照文獻［7］。紅細胞懸液制備方法同溶血試驗。本實驗選取HP3-SBE2-β-CD作為受試物，M-β-CD為對照。將配好的兩種環糊精溶液與紅細胞懸液以1∶1混合，使其終濃度都分別為10、5和2．5 mmol·L－1，然后37 ℃ 水浴。1 h后將各管中的液體以1 500 r·min－1離心 5 min，棄上清，PBS 洗兩遍。各管中分別加入適量的2．5%戊二醛溶液，于4℃ 固定12 h以上。PBS洗兩遍，將紅細胞重懸到適當濃度進行細胞涂片，之后進行30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每步10 min。樣品片剪為大小合適的小片，黏附于載物臺上鍍金，掃描電鏡觀察。

1．2．3 HPn-SBEm-β-CD 對小鼠神經精神系統的影響［8－9］(1)對小鼠一般行為的影響。取小鼠40只，隨機分為4組，即HP4-SBE3-β-CD 3個劑量組(80、160、320 mg·kg－1)和對照組;觀察各給藥組在靜脈注射給藥后小鼠的行為表現、姿勢、步態、被毛、飲食、大小便、眼、黏膜、瞳孔等變化。(2)對小鼠自主活動次數的影響。取健康小鼠，預選5 min內活動次數在220～320之間的共50只，隨機分為5組，即空白對照組、陽性對照組(氯丙嗪 2 mg·kg－1)、HP4-SBE3-β -CD 3 個劑量組(80、160、320 mg·kg－1)。靜脈注射給藥，用六光道自發活動儀分別記錄給藥后即刻、30、60、120及180 min的小鼠5 min內的自主活動次數。

1．2．4 HPn-SBEm-β-CD 對麻醉犬呼吸系統及心血管系統的影響［9］取Beagle犬24只，隨機分為4組，即空白對照組和HP4-SBE3-β-CD 3個劑量組(40、80、160 mg·kg－1)。以戊巴比妥鈉 40 mg·kg－1腹腔注射麻醉后，背位固定，右頸總動脈插管連接TP-101型壓力換能器記錄收縮壓(SAP)舒張壓(DAP)及平均動脈壓(MAP);針形電極刺入皮下記錄Ⅱ導聯心電圖(ECG);氣管插管連接呼吸換能器，記錄呼吸頻率及幅度。術后穩定20 min，用多導生理記錄儀記錄上述各項指標，作為給藥前基礎值。然后靜脈注射給藥后30、60、120及180 min時記錄上述各項指標，觀察呼吸頻率、幅度及心電、心率和血壓的變化。

1． 3 統計學處理

2 結 果

2． 1 HPn-SBEm-β -CD 的溶血試驗

本實驗以 β-CD 、HP-β-CD 、SBE7-β-CD 為對照，進行溶血試驗。結果表明:在測試濃度下，所有化合物的溶血性均遠遠小于β-CD;多數化合物的溶血性小于對照品 HP-β-CD;化合物HP2-SBE3-β-CD、HP1-SBE4-β-CD、HP3-SBE6-β-CD 等的溶血性小于SBE7-β -CD;少量化合物在濃度 ＞25 mmol·L－1時溶血性大于HP-β-CD。見圖1～3。

2． 2 紅細胞形態變化

掃描電鏡結果顯示，5 mmol·L－1和10 mmol·L－1的HP3-SBE2-β -CD 對紅細胞形態無影響，2．5 mmol·L－1的M-β-CD使紅細胞形狀發生了改變，而且細胞濃度降低，而5 mmol·L－1的M-β-CD完全破壞了細胞膜的完整性，幾乎看不到正常的紅細胞形態。見圖4。

圖1 HP-β-CD、HP1-SBE4-β-CD、HP2-SBE3-β-CD、HP3-SBE6-β-CD、SBE7-β-CD溶血性試驗結果Fig 1 Hemolytic activity results of HP-β -CD，HP1-SBE4-β -CD，HP2-SBE3-β -CD，HP3-SBE6-β -CD，SBE7-β -CD

圖2 β-CD、HP-β-CD、HP5-SBE3-β-CD、HP4-SBE2-β-CD、HP4-SBE3-β-CD、HP2-SBE2-β-CD溶血性試驗結果Fig 2 Hemolytic activity results of β -CD，HP-β -CD，HP5-SBE3-β -CD，HP4-SBE2-β -CD，HP4-SBE3-β -CD，HP2-SBE2-β -CD

圖3 β-CD、HP-β-CD、HP3-SBE2-β-CD、HP5-SBE2-β-CD、HP3-SBE4-β-CD、HP6-SBE2-β-CD溶血性試驗結果Fig 3 Hemolytic activity results of β -CD，HP-β -CD，HP3-SBE2-β -CD，HP5-SBE2-β -CD，HP3-SBE4-β -CD，HP6-SBE2-β -CD

圖4 掃描電鏡觀察各種環糊精作用下兔血紅細胞的形態Fig 4 Effects of different CD on morphological changes of RBC by SEM

2． 3 HP4-SBE3-β-CD對小鼠神經精神系統的影響

2．3．1 對小鼠一般行為的影響 小鼠分別靜脈注射80、160 及 320 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，其行為表現、活動姿勢、被毛、飲食、大小便、黏膜、瞳孔均未見異常，與對照組比較差異無統計學意義(P＞0．05)，表明HP4-SBE3-β-CD對小鼠一般行為無明顯影響。

2．3．2 對小鼠自發活動次數的影響 小鼠分別靜脈注射 80、160 及320 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，其自發活動次數各時間點與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0．05)，給予氯丙嗪(2 mg·kg－1)的小鼠自發活動次數與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0．05)，表明HP4-SBE3-β-CD對小鼠自發活動無明顯影響。見表1。

表1 HP4-SBE3-β-CD對小鼠自發活動的影響Tab 1 Effects of HP4-SBE3-β-CD on spontaneous action of mouse次·(5 min)－1

表1 HP4-SBE3-β-CD對小鼠自發活動的影響Tab 1 Effects of HP4-SBE3-β-CD on spontaneous action of mouse次·(5 min)－1

與對照組比較，a P ＞0．05，b P ＞0．05

組 別 n用藥后不同時間自發活動10 316±46 277±46 225±55 187±24 170±36 HP4-SBE3-β -CD 組80 mg·kg－1 10 319±50 246±79a 225±38a 179±20a 166±45a 160 mg·kg－1 10 289±43 227±70a 207±63a 181±40a 150±48a 320 mg·kg－1 10 296±43 248±59a 206±56a 193±41a 146±53a氯丙嗪組 10 302±75 57±40b 16±20b 22±19b 25±28 30 min 60 min 120 min 180 min對照組用藥前自發活動b

2． 4 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬呼吸及心血管系統的影響

2．4．1 對呼吸系統的影響 分別靜脈注射40、80、160 mg·kg－1的 HP4-SBE3-β -CD 后，各時間點麻醉犬的呼吸頻率、幅度與對照組比較差異無統計學意義(P＞0．05)，用藥后與用藥前比較差異也無統計學意義(P＞0．05)，表明 HP4-SBE3-β-CD 對麻醉犬呼吸系統無明顯影響。見表2。

表2 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬呼吸的影響(n=6)Tab 2 Effects of HP4-SBE3-β -CD on the respiratory system of anesthetical dogs(n=6，)

表2 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬呼吸的影響(n=6)Tab 2 Effects of HP4-SBE3-β -CD on the respiratory system of anesthetical dogs(n=6，)

與對照組比較，a P ＞0．05;與用藥前比較，b P ＞0．05

組 別 用藥前呼吸頻率/次·min－1 用藥后不同時間呼吸頻率/次·min－1 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 17．8 ±5．60 16．7 ±6．09 18．3 ±5．85 19．5 ±5．92 20．0 ±5．25 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 19．5 ±3．67 20．5 ±5．17ab 20．7 ±3．72ab 19．3 ±4．23ab 20．0 ±5．25ab 80 mg·kg－1 18．5 ±6．41 20．3 ±5．50ab 19．7 ±6．05ab 19．8 ±6．99ab 21．3 ±7．94ab 160 mg·kg－1 18．0 ±4．24 19．0 ±3．46ab 19．7 ±2．73ab 20．8 ±3．81ab 20．3 ±2．94ab組 別 用藥前呼吸幅度/mm 用藥后不同時間呼吸幅度/mm 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 14．2 ±1．33 14．8 ±0．76 13．5 ±0．84 13．2 ±1．47 14．0 ±1．09 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 13．3 ±1．50 14．8 ±1．83ab 14．8 ±2．04ab 14．3 ±1．21ab 14．7 ±2．06ab 80 mg·kg－1 13．54 ±1．76 14．5 ±1．76ab 14．3 ±1．86ab 14．8 ±1．16ab 15．0 ±1．90ab 160 mg·kg－1 13．5 ±2．73 14．2 ±2．32ab 13．8 ±1．94ab 14．0 ±1．90ab 14．2 ±2．14ab

2．4．2 對心血管系統的影響 分別靜脈注射給予40、80、160 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，各時間點麻醉犬的心電、心率和血壓與對照組比較差異無統計學意義(P＞0．05)，用藥后與用藥前比較差異也無統計學意義(P＞0．05)，表明 HP4-SBE3-β-CD 對麻醉犬心血管系統無明顯影響。見表3～5。

表3 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬心電圖的影響(n=6，x±s)Tab 3 Effects of HP4-SBE3-β -CD on ECG of anesthetical dogs(n=6，)

表3 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬心電圖的影響(n=6，x±s)Tab 3 Effects of HP4-SBE3-β -CD on ECG of anesthetical dogs(n=6，)

與對照組比較，a P ＞0．05;與用藥前比較，b P ＞0．05

組 別 用藥前P-R/s 用藥后不同時間P-R/s 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 80 mg·kg－1 0．102 ±0．007 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 160 mg·kg－1 0．104 ±0．008 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab組 別 用藥前QRS/s 用藥后不同時間QRS/s 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 80 mg·kg－1 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 160 mg·kg－1 0．045 ±0．003 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab組 別 用藥前Q-T/s 用藥后不同時間Q-T/s 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 0．210 ±0．019 0．211 ±0．019ab 0．210 ±0．019ab 0．210 ±0．019ab 0．211 ±0．019ab 80 mg·kg－1 0．208 ±0．012 0．205 ±0．016ab 0．206 ±0．015ab 0．207 ±0．013ab 0．207 ±0．013ab 160 mg·kg－1 0．208 ±0．016 0．207 ±0．017ab 0．207 ±0．017ab 0．208 ±0．016ab 0．208 ±0．016ab

表4 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬心率的影響(n=6，)Tab 4 Effects of HP4-SBE3-β -CD on heart rate of anesthetical dogs(n=6，x±s) 次·min－1

表4 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬心率的影響(n=6，)Tab 4 Effects of HP4-SBE3-β -CD on heart rate of anesthetical dogs(n=6，x±s) 次·min－1

與對照組比較，a P ＞0．05;與用藥前比較，b P ＞0．05

用藥后不同時間心率組．2 190．0 ±18．8 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 188．8 ±18．2 188．2 ±19．2ab 189．3 ±22．6ab 188．5 ±23．2ab 190．0 ±19．1ab 80 mg·kg－1 187．5 ±18．5 194．5 ±18．9ab 198．3 ±18．9ab 195．8 ±18．8ab 197．8 ±18．7ab 160 mg·kg－1 185．3 ±22．1 187．3 ±23．8ab 188．5 ±21．4ab 190．7 ±19．2ab 188．8 ±18．0 30 min 60 min 120 min 180 min對照組 187．3 ±10．6 185．72 ±14．9 191．3 ±20．2 192．7 ±18別用藥前心率ab

表5 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬血壓的影響(n=6，x±s)Tab 5 Effects of HP4-SBE3-β -CD on blood pressure of anesthetical dogs(n=6，) mmHg

表5 HP4-SBE3-β-CD對麻醉犬血壓的影響(n=6，x±s)Tab 5 Effects of HP4-SBE3-β -CD on blood pressure of anesthetical dogs(n=6，) mmHg

與對照組比較，a P ＞0．05;與用藥前比較，b P ＞0．05注:1 mmHg=0．133 kPa

用藥后不同時間收縮壓30 min 60 min 120 min 180 min對照組 145．5 ±15．6 144．0 ±13．8 144．7 ±18．2 144．0 ±19．2 144．0 ±18．3 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 148．3 ±15．0 147．5 ±15．8ab 145．8 ±16．3ab 147．2 ±18．6ab 147．7 ±20．2ab 80 mg·kg－1 144．7 ±15．5 148．0 ±15．5ab 150．3 ±15．9ab 149．7 ±14．9ab 148．7 ±13．4ab 160 mg·kg－1 146．0 ±14．8 144．3 ±17．2ab 148．0 ±13．3ab 149．5 ±13．2ab 149．3 ±12．8ab組 別 用藥前舒張壓 用藥后不同時間舒張壓30 min 60 min 120 min 180 min對照組 104．8 ±10．6 102．5 ±11．7 103．7 ±13．0 101．8 ±14．4 102．5 ±14．1 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 104．0 ±9．4 103．3 ±11．1ab 101．8 ±12．7ab 101．8 ±11．8ab 100．2 ±15．1ab 80 mg·kg－1 103．0 ±10．6 103．3 ±10．6ab 105．5 ±12．2ab 104．7 ±9．4ab 104．7 ±10．2ab 160 mg·kg－1 101．5 ±9．3 99．3 ±11．7ab 100．0 ±9．0ab 103．7 ±9．8ab 102．3 ±10．4ab組 別 用藥前收縮壓用藥后不同時間平均動脈壓30 min 60 min 120 min 180 min對照組 121．3 ±12．7 117．8 ±11．3 119．5 ±16．4 118．2 ±17．4 119．2 ±17．2 HP4-SBE3-β -CD 組40 mg·kg－1 120．5 ±11．5 120．3 ±12．6ab 119．0 ±14．1ab 119．2 ±15．0ab 115．3 ±14．5ab 80 mg·kg－1 119．2 ±11．2 120．5 ±12．7ab 122．2 ±13．6ab 120．7 ±12．3ab 121．3 ±11．4ab 160 mg·kg－1 119．0 ±11．8 116．2 ±12．8ab 117．8 ±11．1ab 119．2 ±11．3ab 119．7 ±11．4ab組 別 用藥前平均動脈壓

3 討 論

環糊精作為藥用輔料應用越來越廣泛，非腸道應用其安全性是首要考慮的因素。目前研究比較多的是HP-β-CD和 SBE-β-CD，兩者的安全性比其他 CDD要可靠。

很多報道［10－14］認為，環糊精特別是甲基化環糊精的毒性來自于其能溶解細胞膜上磷脂、膽固醇等分子，引起細胞膜成分耗竭，以致細胞死亡，而且溶血程度與溶解膽固醇程度相一致［15］。HPn-SBEm-β-CD引入了羥丙基和磺丁基兩種基團，二者是能夠有效降低母體環糊精溶血作用的親水性基團，本研究結果顯示，各種取代物的溶血性都低于β-CD，也低于常用的藥物賦形劑 HP-β -CD，部分取代物(HP2-SBE3-β -CD、HP1-SBE4-β -CD、HP3-SBE6-β -CD)溶血性低于 SBE7-β -CD。結果表明溶血性與羥丙基和磺丁基取代度直接相關:當磺丁基的取代度≤2時表現出較大的溶血性;當磺丁基的取代度≥2．5時，溶血性顯著降低;當總取代度為4～7，其中磺丁基取代度為3～3．5時溶血性最低。同時掃描電鏡結果顯示，HP3-SBE2-β-CD對紅細胞形態影響明顯低于M-β-CD，說明HPn-SBEm-β-CD耗竭細胞膜成分的能力弱，對細胞膜毒性小。

本研究結果表明，HPn-SBEm-β-CD對受試動物呼吸系統和心血管系統無影響，顯示樣品無活性。本實驗的HPn-SBEm-β-CD具有適度的平均分子質量，如總取代度=5且溶血作用顯著低于HP5-β-CD的HP1-SBE4-β -CD、HP2-SBE3-β -CD 和 HP3-SBE2-β -CD的平均分子量范圍為1 571～1 730，遠低于SBE7-β-CD的2 089～2 264平均分子量。這對控制制劑中賦形劑使用量有重要而實際的意義。綜上所述，本實驗的HPn-SBEm-β-CD毒性低，具有極好的應用前景。

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