新生大鼠缺氧/缺血性腦損傷時皮層神經元HIF-1α的表達與凋亡相關基因P53、Bcl-2的關系

王娟，張玉真，蔣犁

(東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009)

缺氧/缺血性腦損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導致的胎兒或新生兒腦損傷，是新生兒時期最常見且嚴重的神經系統(tǒng)損傷［1］，至今仍無有效的治療方法。HIBD過程中神經元損傷主要表現(xiàn)為壞死和凋亡，凋亡引起的損傷更嚴重［2］。缺氧誘導因子-1α(hypoxia induced factor-1α，HIF-1α)是一種在缺氧應答過程中起重要作用的核轉錄因子。目前的研究結果顯示，HIF-1α廣泛參與各種細胞的凋亡過程［3］，但在新生大鼠腦組織中其與神經元凋亡的關系國內研究很少。研究表明，細胞凋亡過程受多種基因調控，P53和 Bcl-2被認為是凋亡的標志性基因［4－5］。因此，我們以新生7日齡SD大鼠HIBD模型為研究對象，觀察HIBD傷后皮層HIF-1α的表達情況及其與P53和Bcl-2的關系，并與單純缺氧組及假手術組比較，探討新生大鼠腦HIBD時HIF-1α與神經元凋亡的關系。

1 材料和方法

1． 1 動物分組和模型建立

1．1．1 動物分組 新生7日齡SD大鼠，雌雄不限，體重11～16 g，由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物隨機分為假手術組(n=6)、單純缺氧組(n=30)和缺氧/缺血組(n=30)。單純缺氧組和缺氧/缺血組按缺氧和缺氧/缺血后斷頭時間不同又分為3、6、12、24、72 h 5個亞組，每個亞組動物數(shù)相同(n=6)。

1．1．2 動物模型的建立 按照經典Rice方法［6］建立HIBD動物模型。SD大鼠經乙醚麻醉后取仰臥位固定，頸正中切口，假手術組僅分離右側頸總動脈，不作任何處理;單純缺氧組分離右側頸總動脈，不結扎，僅作缺氧處理，方法同缺氧/缺血組;缺氧/缺血組分離并結扎右側頸總動脈，縫合皮膚，術后回籠恢復2 h，然后放入缺氧容器中，充以濕化的92%氮氣-8%氧氣混合氣體(1 L·min－1)2 h，回到常氧環(huán)境中恢復飼養(yǎng)。

1．1．3 標本采集 大鼠經10%水合氯醛(350 mg·kg－1)麻醉后，心臟灌注40 g·L－1多聚甲醛內固定，開顱將腦組織完整取出，放入40 g·L－1多聚甲醛固定3～7 d，選取視交叉到視丘的腦組織，厚約5 mm，經脫水透明包被后石蠟包埋切片，切片厚約6 μm，備用。

1． 2 HE 染色

石蠟組織切片經二甲苯及梯度酒精脫蠟水化處理后，HE染色10 min，自來水沖洗約10 min洗去多余的液體，鹽酸酒精分化，鏡下觀察控制分化程度，自來水沖洗返藍，放入95%乙醇數(shù)秒，伊紅染色液染色2 min。脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，而細胞漿呈粉紅色。

1． 3 HIF-1α、P53 和 Bcl-2 蛋白表達檢測

將切片脫蠟，梯度酒精水化，3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，微波抗原修復后加山羊血清封閉20 min，棄去多余液體，分別加入抗HIF-1α大鼠多克隆抗體(1∶50)、P53鼠多克隆抗體(1∶100)、Bcl-2鼠多克隆抗體(1∶100)，4℃過夜。充分洗滌后，加生物素標記的抗大鼠IgG抗體(1∶100)孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育1 h，充分洗滌，DAB顯色，顯微鏡下控制反應顏色，自來水沖洗，終止顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，陽性細胞顯色為棕黃色。空白對照組不加抗HIF-1α大鼠多克隆抗體、P53鼠多克隆抗體、Bcl-2鼠多克隆抗體，其余步驟同前，均無陽性細胞表達。顯微鏡下觀察HF-1α、P53和Bcl-2表達情況，取右側大腦皮層3個視野，放大400倍，計算100個神經元中陽性染色的細胞數(shù)。

1． 4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2． 1 HE 染色結果

單純缺氧組和缺氧/缺血組均可見不同程度的細胞胞體腫脹，氣體樣變，細胞稀疏，間隙增寬，細胞排列紊亂，結構不清，核固縮變圓，主要表現(xiàn)見于皮層和海馬區(qū)，證實模型建立成功。單純缺氧組細胞損傷程度較缺氧/缺血組輕，缺氧或缺氧/缺血損傷后24 h皮層神經元損傷最重，細胞溶解缺失明顯。假手術組皮層神經元排列有序，細胞核大，胞漿少，見圖1。

圖1 缺氧后24 h各組皮層區(qū)HE染色 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 1 HE staining of cortex in brain tissues at 24 h after hypoxia in each group 10×40

2． 2 HIF-1α的表達和分布

假手術組腦組織HIF-1α蛋白僅有少量表達。單純缺氧組和缺氧/缺血組皮層區(qū)HIF-1α在單純缺氧或缺氧/缺血后表達增多(P＜0．05)，主要分布于皮層、海馬等部位;單純缺氧和缺氧/缺血后3 h HIF-1α開始出現(xiàn)表達，12 h達高峰，24 h后降低，72 h仍可見其少量表達。在同一時間點上，單純缺氧組皮層區(qū)HIF-1α表達較缺氧/缺血組高，但差異無統(tǒng)計學意義。見表1、圖2。

2． 3 P53和Bcl-2蛋白表達與分布

單純缺氧組和缺氧/缺血組P53和Bcl-2主要分布于皮層和海馬區(qū)。單純缺氧組和缺氧/缺血組皮層區(qū)P53蛋白在單純缺氧和缺氧/缺血后3 h表達增多，12 h表達明顯，24 h表達達高峰，72 h表達仍較明顯。高倍鏡下P53蛋白表達強的細胞受損較重，形態(tài)變化明顯。單純缺氧組24 h時皮層區(qū)P53蛋白表達較缺氧/缺血組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。見表1、圖3。

表1 大鼠單純缺氧和缺氧/缺血后不同時間點皮層區(qū)HIF-1α、P53及Bcl-2陽性細胞表達情況Tab 1 Comparison of positive cell of HIF-1α、P53 and Bcl-2 in cortex after hypoxia or hypoxia ischemia in neonatal rats

表1 大鼠單純缺氧和缺氧/缺血后不同時間點皮層區(qū)HIF-1α、P53及Bcl-2陽性細胞表達情況Tab 1 Comparison of positive cell of HIF-1α、P53 and Bcl-2 in cortex after hypoxia or hypoxia ischemia in neonatal rats

與假手術相比較，a P＜0．05;與同組內前一時間點比較，b P＜0．05;與單純缺氧組同一時間點比較，c P＜0．05

組 別 n HIF-1α陽性細胞數(shù) P53陽性細胞數(shù) Bcl-2陽性細胞數(shù) P53/Bcl-2值10．5 ±1．52 7．0 ±2．45 6．8 ±2．26 1．03單純缺氧組3 h 6 21．5 ±2．51a 15．83 ±2．48a 18．17 ±2．13a 0．87 6 h 6 28．83 ±2．64ab 19．5 ±1．87ab 25．0 ±3．03ab 0．78 12 h 6 34．83 ±1．94ab 27．33 ±2．94ab 33．67 ±2．50ab 0．81 24 h 6 28．0 ±1．79ab 28．5 ±2．74a 23．0 ±3．16ab 1．24 72 h 6 23．83 ±1．72ab 23．5 ±2．43ab 22．33 ±4．72a 1．05缺氧/缺血組3 h 6 18．5 ±2．17a 18．83 ±1．72ac 21．17 ±2．93a 0．89 6 h 6 24．83 ±1．72abc 22．33 ±2．42ac 25．0 ±2．90ab 0．89 12 h 6 31．83 ±4．53ab 31．17 ±2．78ab 36．0 ±2．61ab 0．87 24 h 6 25．6 ±2．06ab 35．5 ±1．64abc 28．1 ±2．14abc 1．26 72 h 6 21．17 ±2．32abc 28．6 ±2．25abc 24．67 ±1．75a假手術組6 1．16

圖2 缺氧后12 h各組皮層區(qū)HIF-1α的表達 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 2 Expression of HIF-1α at 12 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

圖3 缺氧后24 h各組皮層區(qū)P53的表達 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 3 Expression of P53 at 24 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

假手術組腦組織Bcl-2蛋白陽性表達低，單純缺氧組和缺氧/缺血組皮層區(qū)Bcl-2蛋白在單純缺氧或缺氧/缺血后3 h表達增多，12 h達高峰，24 h后逐漸下降，72 h仍有少量表達。高倍鏡下Bcl-2顯色深的細胞形態(tài)較為正常，細胞核完整。單純缺氧組12 h時皮層區(qū)Bcl-2蛋白表達較缺氧/缺血組減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05)。見表1、圖4。

圖4 缺氧后12 h各組皮層區(qū)Bcl-2的表達 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 4 Expression of Bcl-2 at 12 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

2． 4 HIF-1α與P53、Bcl-2表達的相關性分析

HIF-1α陽性細胞數(shù)與P53陽性細胞數(shù)表達呈正相關(單純缺氧組 r=0．589，P ＜0．01;缺氧/缺血組r=0．531，P ＜0．01);HIF-1α 陽性細胞數(shù)與 Bcl-2 陽性細胞表達呈正相關(單純缺氧組r=725，P＜0．01;缺氧/缺血組 r=0．811，P ＜0．01)。假手術組 P53/Bcl-2值約等于1，單純缺氧組和缺氧/缺血組3、6和12 h這3個時間點上P53/Bcl-2值小于1，單純缺氧組和缺氧/缺血組24 h和72 h這兩個時間點上P53/Bcl-2值大于1。

3 討 論

在生理和病理狀態(tài)下，細胞或機體對缺氧的適應能力對其存活十分重要。目前研究已證實:當組織或細胞缺氧時會發(fā)生不同程度的細胞凋亡。HIF-1是一種在維持氧平衡中起重要作用的轉錄調節(jié)因子［7］，由α和β亞單位組成，其中α是活性單位，β是結構單位。在常氧下HIF-1α是一種極不穩(wěn)定的蛋白，主要由細胞內的泛素蛋白酶將其降解，其半衰期不超過5 min。當?shù)脱鯐r，泛素蛋白酶的活性受抑制，HIF-1α穩(wěn)定性增加，與HIF-1 β形成異二聚體，結合到核DNA序列，引起多種靶基因的轉錄激活，如促紅細胞生成素、糖酵解酶、血管內皮生長因子等［8］。

本研究結果顯示，HIF-1α表達主要分布于皮層和海馬等部位，在單純缺氧和HIBD中其表達具有時間規(guī)律性，即在單純缺氧或缺氧/缺血3 h后皮層區(qū)HIF-1α出現(xiàn)表達增加，12 h達高峰，以后其表達量呈下降趨勢。我們推測，單純缺氧或缺氧/缺血使HIF-1α穩(wěn)定性增加，其表達也隨之增加，但隨著復氧時間的延長，缺氧程度減輕，泛素蛋白酶活性增強，加速HIF-1α降解，使其表達減少，因而表現(xiàn)為先升后降的趨勢。在正常組織中，促凋亡與抗凋亡維持在一定的動態(tài)平衡中。我們的實驗結果顯示，假手術組大鼠腦組織P53/Bcl-2值約等于1，也就是說在正常腦組織中P53和Bcl-2維持著平衡，而當細胞受到凋亡等信號刺激，此平衡被打亂，相應的促凋亡基因表達增多，抗凋亡基因表達相對減少，反之亦然［3］。單純缺氧組或缺氧/缺血組在3、6、12 h這3個時間點上P53/Bcl-2值小于1，單純缺氧組或缺氧/缺血組在24 h和72 h這兩個時間點上P53/Bcl-2值大于1，也就是說在3、6和12 h這3個時間點上細胞主要以抗凋亡為主，24 h和72 h這兩個時間點上主要以促凋亡為主。我們認為，這可能與HIF-1α表達下降導致Bcl-2表達減少有關。因此，我們推測，在新生大鼠腦HIBD中，HIF-1α在缺氧損傷早期可能具有抗凋亡作用，與Fan等［9－10］關于HIF-1α在新生大鼠HIBD的研究結果是一致的，提示在HIBD早期自我保護機制啟動，這給臨床醫(yī)師快速干預提供了時間窗。但本實驗僅從HIF-1α與P53和Bcl-2的表達上進行分析，尚未涉及對HIF-1α的干預研究，對此，仍需進行進一步的實驗研究。

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