中國野生華東葡萄抗白粉病相關(guān)基因(VpUSP)克隆及表達(dá)分析

摘要：根據(jù)從本課題組前期構(gòu)建的中國野生葡萄華東葡萄株系白河-35-1在白粉病誘導(dǎo)下的cDNA文庫中獲得的1條與抗白粉病相關(guān)的EST序列，設(shè)計(jì)特異引物，結(jié)合RACE(Rapid-amplmcation of cDNA ends)技術(shù)克隆了中國野生華東葡萄白河-35-1廣泛逆境蛋白基因(universal stress protein，USP)全長序列。該基因全長836bp，編碼175個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為GU946975。進(jìn)一步研究該基因在白粉菌誘導(dǎo)下的相對(duì)表達(dá)水平，我們通過半定量RT-PCR技術(shù)，研究了VpUSP在中國野生華東葡萄抗病、感病株系中的表達(dá)變化，結(jié)果表明，廣泛逆境蛋白在中國野生華東葡萄感病株系中，接種白粉病前后均有表達(dá)，但表達(dá)量變化不明顯；然而，抗病的中國野生華東葡萄株系在接種白粉病后VpUSP基因表達(dá)量呈明顯的增加趨勢(shì)，初步表明中國野生華東葡萄VpUSP基因在與白粉病菌互作過程中具有表達(dá)活性。

關(guān)鍵詞：中國野生葡萄；RACE(Rapid-amphfication ofcDNA ends)；葡萄白粉病

中圖分類號(hào)：$663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2011)01-156-05

葡萄白粉病[Uncinula necator(Schw.)Burr]是嚴(yán)重危害世界葡萄生產(chǎn)的一種真菌性病害。在葡萄著名產(chǎn)區(qū)如美國加州，法國，意大利，澳大利亞，中國新疆等地區(qū)，葡萄白粉病危害比較嚴(yán)重，給葡萄生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。前人對(duì)中國抗白粉病野生葡萄種質(zhì)做了大量研究，利用基因工程手段與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，發(fā)掘抗病葡萄種質(zhì)的抗病基因，培育抗病新品種是解決此問題的有效途徑之一。

廣泛逆境蛋白(Universal stress protein，USP)是一種普遍存在于植物中的抗性相關(guān)蛋白，一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，在植物受到外界脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)植物的抗逆性。USP在水稻中至少由10個(gè)基因編碼，在擬南芥中由17個(gè)基因編碼，它們都被定位在第5條染色體上。在許多雙子葉植物與單子葉植物受到非生物脅迫時(shí)，USP基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，但在植物受到生物脅迫時(shí)的USP基因克隆方面的研究尚未見報(bào)道。

研究從中國野生華東葡萄株系白河35-1白粉病病原菌誘導(dǎo)的eDNA文庫獲得一條與廣泛逆境蛋白相關(guān)EST序列，結(jié)合RACE(Rapid-amplificationofcDNA ends)技術(shù)，獲得了該基因全長序列。同時(shí)。通過半定量RT-PCR技術(shù)，研究了該基因在中國野生華東葡萄抗病、感病株系受白粉菌誘導(dǎo)條件下的表達(dá)變化模式，為進(jìn)一步研究該基因的在中國野生華東葡萄中的抗病性作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材與試劑

研究以中國野生華東葡萄抗性株系及后代白河-35-1，白河-13-1，“6-12-6”為試材，并以中國野生華東葡萄感病株系及后代白河-35-2，廣西-2，“6-12-2”為對(duì)照。對(duì)健康無菌的葉片進(jìn)行套袋1周后，選取幼葉。用無菌蒸餾水噴濕接種葉片的近軸面，取田間自然感病的白粉菌葉片，用壓片法進(jìn)行人工葡萄白粉菌接種，接種后立即套袋。在白粉菌接種后0、6、12、24、48、72、96h采集1.0cm²大小的葡萄幼葉葉片，在液氮中速凍后，置于-80℃冰箱備用，重復(fù)3次。

RACE試劑盒購自Clontech(美國)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pGEM T-easyVector載體購自Promage(美國)公司。DL2000 DNA Marker、rTaq酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 接種白粉病后葉片總RNA的提取 用改進(jìn)的SDS／酚法分別從中國野生華東葡萄白河-35-1葉片中提取經(jīng)白粉病菌誘導(dǎo)接種后0、6、12、24、48、72、96h的葡萄葉片總RNA。經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取總RNA的完整性，并用NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度和濃度。

1.2.2 白河-35-1 VpUSP全長基因的克隆根據(jù)已獲得白粉菌誘導(dǎo)華東葡萄白河-35-1表達(dá)基因cD-NA文庫中(本實(shí)驗(yàn)室2008年構(gòu)建，結(jié)果未發(fā)表)的EST核心序列(GenBank登錄號(hào)：GR884460)，設(shè)計(jì)RACE特異引物

GSP1：5’-GGTGTGGGGAAAATGGAGAGTGAGCC-3’

GSP2：5’-CGCTTGCTGCTAATAGAGGGGTGTGGAT-3’

以接種白粉病菌的白河-35-1葉片提取的RNA混合樣為模板，采用BD SMARTTM RACE eDNAAmplification Kit(BD Bio sciences Clontech)，具體操作按說明書的方法進(jìn)行RACE eDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)條帶。

回收產(chǎn)物與克隆載體pGEM-T Easy于4℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10.在附加Amp的平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色單克隆，接種于附加Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床160r·min^-1，培養(yǎng)16-18h。經(jīng)菌液PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，送公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序獲得的VpUSP基因的5’端序列和3’端序列，利用DNAstar軟件將其拼接，獲得全長中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP基因cDNA全長序列。

1.2.3 白河-35-1VpUSP基因的生物信息學(xué)分析-中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP的全長基因開放閱讀框(ORF)分析在NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)程序進(jìn)行；推導(dǎo)的氨基酸序列相似性比對(duì)采用NCBI的Blastx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；應(yīng)用DNAstar對(duì)來源于不同植物的廣泛逆境蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 VpUSP基因誘導(dǎo)表達(dá)分析

根據(jù)已獲得的中國野生華東葡萄白河-35-1VpUSP基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物VDUSP1:5’-AGAGTAGC-CAACTCGG-3’與VpUSP2:5’-TCAGTC ATCAACTGGGTC-3’用于RT-PCR分析。同時(shí)以3-磷酸甘油醛基因GAPDH為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)合成引物GAPDH1:5’-AACATTGTGCCAACATCCA-3’與GAPDH2:5’-ACCCCATrCATTGTCATAC-3’。分別-以白粉菌誘導(dǎo)的抗病葡萄株系白河35-1.6-12-6白河13-1與感病葡萄株系白河-35-2，6-12-2，廣西一2在不同時(shí)間提取的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板。進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：10xPCR緩沖液(Mg²+Plus)2.5μL，dNTPs(2.5 mmol·L^-1)2μL，上游引物和下游引物各1μL，rTaq0.125μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，超純水補(bǔ)齊至25μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃3min；進(jìn)人如下循環(huán)：94℃30S，退火溫度52℃30S，72℃1min；25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。取10μL的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，觀察PCR產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度，從而獲得該基因的表達(dá)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 白河-35-1VpUSP基因全長序列的獲得

以接種后0、6、12、24、48、72、96h的RNA等量混合為模板，根據(jù)Clontech公司RACE試劑盒說明書要求進(jìn)行RACE-PCR(圖1)，獲得5’端cDNA序列180bp和3’端cDNA序列900 bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)克隆測(cè)序后，利用DNAstar軟件進(jìn)行拼接獲得了-中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP基因836bp的全長cDNA序列。

在獲得了中國野生華東葡萄白河-35-1VpUSP基因全長序列的基礎(chǔ)上，通過NCBI的ORFfinder程序?qū)Λ@得的目標(biāo)基因進(jìn)行了開放閱讀框分析，VpUSP基因全長836bp，開放閱讀框?yàn)?28bp，編碼176個(gè)氨基酸。

2.2 白河-35-1VpUSP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

以中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP基因推導(dǎo)的氨基酸序列為檢索序列，通過NCBI的BLASTx程序檢測(cè)與其同源的氨基酸序列，中國野生葡萄VpUSP基因編碼的氨基酸序列與來自擬南芥(NP_196972)、(NP_566140)、蕪青(ABV89649)等基因編碼的USP蛋白的氨基酸序列同源性分別為133／175(76％)、126／175(72％)、128／175(73％)；同時(shí)，利用DNAStar軟件，將推導(dǎo)的中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP氨基酸序列與檢索到的其他植物的USP氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，可以看出，中國野生華東葡萄白河35-1VpUSP氨基酸序列與擬南芥usp能聚類在一起，說明2者在進(jìn)化過程中關(guān)系較近；而與其他植物相應(yīng)的usp進(jìn)化距離較遠(yuǎn)(圖2)。

2.3 中國野生華東葡萄VpUSP基因誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用RT-PCR方法。對(duì)中國野生華東葡萄抗病與感病株系接種白粉菌后廣泛逆境蛋白的表達(dá)變化情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在抗感株系未接種白粉菌的葉片中，均能檢測(cè)到usp基因的表達(dá)。

VpUSP基因在抗病葡萄株系白河-35-1，6-12-6，白河-13-1中的表達(dá)受白粉病的誘導(dǎo)，在白河-35-1中，VpUSp基因表達(dá)量變化隨著時(shí)間的增加而逐漸增高，在6-12-6，白河-13-1中，在侵染白粉病48h后表達(dá)量達(dá)到高峰，隨后逐漸降低(圖3)。與之相比，VpUSP基因的在感病葡萄株系6-12-2，廣西2中未接種的表達(dá)量與接種后的表達(dá)量變化不明顯，在感病葡萄株系白河35-2中，表達(dá)量變化不明顯，但在接種白粉菌48、72h時(shí)稍微降低(圖4)。說明VpUSP基因的轉(zhuǎn)錄在抗病葡萄株系白河-35-1，6-12-6，白河-13-1中受白粉病的誘導(dǎo)，VpUSP在與白粉病菌互作過程中具有表達(dá)活性。

3 討論

研究在本課題組前期構(gòu)建的白粉菌誘導(dǎo)下的中國野生華東葡萄白河35-1eDNA文庫中篩選獲得的一條與廣泛逆境蛋白相關(guān)的EST序列。結(jié)合RACE技術(shù)，獲得了該基因的全長序列。通過NCBI網(wǎng)站的核酸、蛋白比對(duì)及進(jìn)化分析及其他植物usp相關(guān)基因的報(bào)道中推測(cè)，我們克隆到的中國野生華東葡萄白河-35-1usp基因?qū)儆趗sp基因家族成員。

USP蛋白在古生菌、細(xì)菌、植物中均被發(fā)現(xiàn)，但在于動(dòng)物中尚未見報(bào)道。USPA蛋白在埃希氏菌屬大腸桿菌細(xì)胞生長受到限制㈣，DNA被損壞時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)；該蛋白在化學(xué)毒素，滲透脅迫，UV照射條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)；被認(rèn)為外界壓力的生物傳感器。在埃希氏菌屬大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，USPA與細(xì)胞分裂蛋白有協(xié)同作用，同時(shí)可激活Re-cA的表達(dá)，RecA蛋白是細(xì)菌中參與DNA同源重組修復(fù)的重要蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分別是細(xì)菌和真核生物參與DNA同源重組修復(fù)的重要蛋白㈣。我們所克隆到的VpUSP基因在中國野生華東葡萄抗性種質(zhì)中均能被葡萄白粉病菌所誘導(dǎo)，至于其是否通過激活Rad51的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞抗性還需要進(jìn)一步研究。

近年來，對(duì)usp基因的研究主要集中在干旱、水分等非生物脅迫誘導(dǎo)方面。在多種植物中研究表明，在植物受到脅迫時(shí)，usp相關(guān)基因表達(dá)量會(huì)明顯上調(diào)，可增強(qiáng)植物的抗逆性。GUSPl和GUSP2在水分脅迫下木本棉中誘導(dǎo)表達(dá)，HSPCB基因在高水分脅迫情況下有益于棉花的生長，ER6基因在番茄成熟過程中被誘導(dǎo)，在果實(shí)形成不同時(shí)期，表達(dá)量隨著時(shí)間的變化而不同，在果實(shí)變?yōu)榧t色時(shí)，表達(dá)量達(dá)到高峰舊；OsUspl基因在深水性水稻受到高水分脅迫1h后被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，并且視為分子調(diào)節(jié)基因。

對(duì)于usp基因在植物生物脅迫方面的研究尚無相關(guān)報(bào)道。我們結(jié)合cDNA文庫及RACE技術(shù)，在中國野生華東葡萄高抗白粉病株系白河-35-1中，篩選得到一條與脅迫相關(guān)的usp基因，利用半定量PCR技術(shù)對(duì)其在葡萄抗白粉病過程中的表達(dá)方式進(jìn)行研究。

我們選擇了中國野生華東葡萄中3個(gè)抗病株系和3個(gè)感病株系分別進(jìn)行該基因的表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VpUSP基因在未受生物脅迫的6個(gè)株系中均有表達(dá)，抗病株系表達(dá)量極其微弱，但在感病株系表達(dá)方式非常獨(dú)特，其表達(dá)水平始終比較強(qiáng)，而根據(jù)以往研究顯示，usp基因是一種誘導(dǎo)型基因，因此在感病株系中的非誘導(dǎo)型的表達(dá)方式還有待進(jìn)一步研究。

在抗病株系中，接種白粉病菌后VpUSP基因表達(dá)量隨著接種時(shí)間的延長而增強(qiáng)，在48h達(dá)到表達(dá)峰值。而后下降。這就表明VpUSP基因在抗病株系中屬誘導(dǎo)性表達(dá)基因，其參與了中國野生華東葡萄的抗病誘導(dǎo)。在抗病葡萄中，這種表達(dá)方式與非生物脅迫在誘導(dǎo)條件下的表達(dá)是相符的。但在感病株系中，接種白粉病菌后，表達(dá)量變化不明顯，表明VpUSP基因?qū)俳M成型表達(dá)基因，在抗白粉病的過程中作用還有待進(jìn)一步研究。