田間蘋果成熟組織RNA高效提取方法

摘要：針對田間蘋果成熟組織富含多酚、多糖和大量次生代謝產(chǎn)物的特點，建立了適合田間蘋果不同組織的高效RNA提取方法，以不同季節(jié)田間生長的蘋果葉片和皮層為材料，用此方法均能在2h左右完成超過10個樣品的總RNA提取，質(zhì)量高、完整性好的總RNA，可用于田間蘋果病毒RT—PCR檢測，獲得良好效果。經(jīng)反復大量試驗證實，該方法適合田間蘋果不同組織的RNA快速提取，操作簡便、快捷、高效，且使其不受季節(jié)限制，有效地提高了田間果樹病毒檢測以及其他分子生物學研究的效率。

關鍵詞：田間蘋果；成熟組織；RNA；高效提取

中圖分類號：$661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-161-04

果樹病毒基因組大多為RNA，利用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術是從分子水平上檢測果樹病毒的重要手段之一。果樹組織中總RNA提取的質(zhì)量是RT-PCR檢測的基礎和關鍵因素。目前，關于各種果樹總RNA提取方法雖有很多文獻報道，但大多以植物幼嫩組織或器官以及組培苗為試材。近年來，關于富含多糖、多酚的植物組織RNA提取方法也有報道，但普遍存在RNA提取過程復雜，步驟繁多，耗時長等問題。而在我國以田間蘋果的成熟組織為材料，且同時適用于不同季節(jié)和不同組織材料的快速、簡便的RNA提取方法報道較少。由于田間蘋果成熟組織富含多糖、多酚和其他豐富的次生代謝產(chǎn)物，一些適用于組培苗以及幼嫩組織的常規(guī)化的快速、簡便的植物RNA提取方法遠遠不能滿足田間蘋果成熟組織的需要。

針對田間蘋果成熟組織的特點，遵循操作簡單，提高效率，減少有毒藥品使用的原則，我們以不同時期的田間蘋果成熟組織為材料，對其RNA的提取方法進行了優(yōu)化，以期獲得一種快速、高效的蘋果成熟組織高質(zhì)量RNA提取方法。

1 材料和方法

1.1 材料

取田間蘋果樹的春季幼葉、夏季生長葉片、秋季老葉以及韌皮組織，4℃下短期保存，用于RNA提取或液氮速凍，儲存于70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蘋果試管苗常規(guī)RNA提取方法

研缽、研杵、鑷子、藥匙等用DEPC-H₂O浸泡后，于180℃烘烤過夜；離心管、各種移液器吸頭等用DEPC-H₂O浸泡，37℃過夜，次日滅菌(121℃，40min)備用；或氯仿浸泡5min之后滅菌，再高溫烘干3h以上備用。

取0.1g蘋果試管苗幼嫩組織，液氮中研磨至粉末狀，迅速收集到1.5mL的經(jīng)上述處理的離心管中并加人RNAplant提取液(天根生化科技有限公司生產(chǎn))0.5mL，震蕩混勻，室溫平放5min，4℃12000r·rain^-1離心lmin；取上清，加入0.1mL的5mol·L^-1的NaCl和0.3mL的氯仿，充分混勻，4℃12000，min^-1離心10min；取上清液，加入與所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min；4℃12000 r.min^-1離心10min，棄上清，留沉淀，75％乙醇洗滌后，超凈臺上晾干，加50μL的DEPC-ddH₂O溶解RNA沉淀。

1.3 田間蘋果成熟組織RNA提取方法的改進

提取RNA所使用的研缽、研杵、藥匙、鑷子、離心管、各種移液器吸頭等無需DEPC-H₂O或氯仿浸泡，直接高壓蒸汽滅菌(121℃，20min)，然后烘干備用。

取0.1g左右的田間蘋果葉片或皮層組織，液氮中研磨至粉末狀，從中取0.005-0.01g迅速轉入1.5mL的經(jīng)高壓滅菌并烘干的離心管中，然后加入RNAplant提取液0.5mL，劇烈震蕩混勻30s，在植物材料勻漿中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％-30％，混勻并靜置片刻；室溫12000r·min_-1離心2min，取上清，加入1/5體積的5mol·L_-1的NaCl或醋酸鉀(pH=4.8)充分混勻，再加入0.35mL的氯仿／異戊醇(24:1)，劇烈震蕩30s(打斷DNA)；室溫12000r·min_-1離心10min，取上清，加入與所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min；室溫離心5min，棄上清，留沉淀，用4℃預冷的70％乙醇0.7mL洗滌沉淀2次，在超凈臺上晾干，加10-20μL的ddH₂O溶解RNA沉淀。

1.4 總RNA的完整性及質(zhì)量檢測

利用瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進行質(zhì)量檢驗。由于改進方法每次取樣量很少，只有0.005-0.01g，導致獲得的總RNA量較少，因此在檢測的時候，可增加植物總RNA與LoadingBuffer的比例，取4μL的總RNA樣品與1μL6×Loading Buffer(4:1)混勻點樣于1.7％的瓊脂糖凝膠(含0.5mg·L^-1的溴化乙錠)中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，5V·cm^-1恒壓電泳20min，在BioRad凝膠成像系統(tǒng)下觀察其完整性并拍照記錄。

1.5 RT-PCR對總RNA的驗證

選用田間帶病毒的植株。對其組織進行RNA提取，以蘋果莖溝病毒(ASGV)為代表，根據(jù)ASGV的已報道序列，設計RT-PCR特異引物。互補引物-(Pc)為5’AAC CCC TITTTGTCC TFC AGTACGAA-3’，同源引物(Ph)為5’-GCC ACTTCTAGGCAGAACTCTTFGAA-3’，引物由寶生物公司合成。加入互補引物，使用TaKaRa公司的AMV反轉錄酶進行反轉錄，得到cDNA，并以該cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增體系為：10xPCR buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol·L^-1)15μL，MgCl₂(25mmol·L_-1)2μL，20μmol·L^-1的Pc引物和Ph引物各0.5μL，Tap(5U·μL)0.3μL，反轉錄產(chǎn)物4μL；ddH₂O 13.7μL；總體積25μL。擴增程序為94℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸1min，循環(huán)30-40次；72℃延伸7min。

2 結果與分析

2.1 總RNA的完整性及其純度

2.1.1 常規(guī)方法提取蘋果田間成熟組織RNA的效果利用常規(guī)方法分別對蘋果試管苗和田間蘋果成熟組織進行RNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA的質(zhì)量和完整性，結果顯示(圖1)，從蘋果試管苗中提取的總RNA電泳時均出現(xiàn)了清晰的28S、18S、5S譜帶；而田間蘋果成熟組織提取的總RNA電泳時18S和28SrRNA連成一片，呈彌散狀，出現(xiàn)了嚴重降解現(xiàn)象。說明適用于蘋果試管苗的常規(guī)RNA提取方法不適用于田間蘋果成熟組織。

2.1.2 改進方法提取田間蘋果成熟組織RNA的效果利用改進方法，對蘋果田間葉片進行RNA提取，取其總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，所有泳道均出現(xiàn)了28S、18S和5SrRNA譜帶，且28SrRNA與18SrRNA條帶清晰，其亮度比大約為2:1。表明用該方法所提取的總RNA無明顯降解，具有較好的完整性(圖2)。

2.1.3 改進方法提取田間蘋果成熟組織RNA的純度檢測

通過D_260nm/D_280nm來檢測RNA純度，D_260nm/D_280nm作為參考值。利用改進方法對蘋果田間葉片進行RNA提取，其總RNA的D_260nm/D_280nm值在1.9-2.0。一般認為，D_260nm/D_280nm值小于1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；D_260nm/D_280nm值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解。由此可見，改進方法提取的蘋果成熟組織總RNA的純度較好。

2.2 RT-PCR驗證提取的RNA質(zhì)量

病毒RNA的逆轉錄活性是檢驗RNA質(zhì)量的一個重要指標，研究利用改進方法提取的田間蘋果成熟組織的總RNA，進行了蘋果莖溝病毒(ASGV)的RT-PCR檢測，結果得到了273bp的特異擴增的cDNA目的片段，從圖3可以看出，目的帶明亮清晰，特異性強，由此可見利用改進方法提取的總RNA反轉錄活性高，且轉錄的cDNA具有良好的可用性。而利用常規(guī)方法對大田蘋果進行RNA提取，用其做蘋果莖溝病毒(ASGV)的RT-PCR檢測，雜帶干擾嚴重，目的帶不清楚，無法準確得到特異擴增的cDNA目的片段。

3 討論

針對田間蘋果成熟組織富含多糖、多酚和大量次生代謝產(chǎn)物的特點，遵循操作簡單，提高效率，減少有毒藥品使用，降低對試驗儀器以及試驗環(huán)境要求的原則，該方法從4個方面改進了蘋果組織常規(guī)RNA提取技術。

(1)提取RNA所用的試驗器皿僅需高壓滅菌和高溫烘烤，不使用氯仿浸泡或DEPC處理，試驗用水使用ddH20代替DEPC處理水，有效減少了有毒藥品的使用。(2)提取過程均在常溫下進行，用普通高速離心機代替冷凍高速離心機并調(diào)整離心時間，降低了對試驗環(huán)境和試驗儀器的要求，并提高了效率。(3)調(diào)整了提取液和植物材料的比例。與試管苗相比，田間蘋果成熟組織含有更多的酚類、萜類物質(zhì)和其他次生代謝產(chǎn)物，并且這些物質(zhì)的含量會隨著植株的生長而增加，同時，各種酶的活性增強，其中包含RNase。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結合，導致RNA活性喪失；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學降解和酶解。由此可見，田間蘋果成熟組織中的總RNA在提取過程中更容易受到破壞和降解，而植物RNA提取緩沖液中的有效成分去除雜質(zhì)和保護RNA的能力有限，為了充分防止RNA的降解保護其完整性，研究中將植物材料用量降低為常規(guī)方法的1／20，有效克服了雜質(zhì)干擾，防止了總RNA降解。此步驟為田間蘋果成熟組織RNA提取成功的關鍵步驟，必須嚴格操作。(4)蘋果田間成熟組織富含多糖，其許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學研究。針對田間蘋果成熟組織單獨使用低濃度乙醇沉淀多糖，或者在高濃度Na⁺+(K⁺)離子條件下，苯酚，氯仿抽提除去多糖都效果不佳，研究中將上述2種方法結合使用，并調(diào)整藥品用量，有效地去除了多糖干擾，大大提高了所提總RNA的質(zhì)量。

利用該方法已對河北省主要蘋果產(chǎn)區(qū)的田間蘋果進行了大量的病毒檢測試驗，對幾百個樣品進行RNA提取，試驗材料包括春季幼葉、夏季葉片、秋季老葉以及皮層組織，均獲得良好效果。經(jīng)反復試驗證實，改進的RNA提取方法簡單易行、快速高效、適用性廣泛。同時，提取的總RNA質(zhì)量高、完整性好，具有較強的反轉錄活性，尤其用于大量樣品提取時，其優(yōu)點顯著，可大大提高效率，減少工作量，明顯降低有毒藥品的使用量和對環(huán)境條件的要求，有效地提高了田間果樹病毒檢測以及其他分子生物學研究的效率。利用該方法，對田間梨的不同組織進行了RNA提取，并用于果樹病毒的RT-PCR檢測和Northern雜交試驗等，均取得良好效果。