二次回歸正交旋轉組合設計在梨子葉不定梢再生研究中的應用

摘要：以水晶×金二十世紀花后90 d的梨成熟胚子葉為外植體，利用二次回歸正交旋轉組合設計對其再生體系研究中的關鍵因素6-BA、NAA、AgNO₃濃度建立數學模型，得到回歸方程y=4.4053+0.8638X₂-0.3869X₂-0.0584X₃-0.0157X₁X₂+0.0005X₁X₃+0.0112X₂X₃-0.6718X¹²-0.2192X²²-0.7499X³²。6-BA、NAA、AgNO₃濃度在試驗設定范圍內對梨成熟胚子葉不定梢再生系數的影響均呈“低促高抑”現象；且培養基中6-BA、NAA、AgNO₃的濃度分別在5.955-7.124mg·L^-1、0.281-0.473mg·L^-1和2.199～2.801mg·L^-1，梨成熟胚子葉不定梢再生系數大于3的可靠性為95％。

關鍵詞：梨；子葉；二次回歸正交旋轉組合設計；再生體系；數學模型

中圖分類號：$661.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-171-05

二次回歸正交設計是回歸分析與正交設計的有機結合，以具有試驗次數少，數據處理簡便，可進行優化分析等優點，已在微型月季、爆仗竹、香石竹等植物組織培養研究中得到廣泛應用。但二次回歸正交設計的不足之處在于：試驗因素空間各試驗點與中心點距離不同，即回歸方程預測值的變異程度不同，因而難以根據試驗結果直接選擇最佳控制區域。而二次回歸正交旋轉組合設計是在二次回歸正交設計的基礎上，使分布在同一個球面上的試驗點的回歸估計值具有相同的方差，從而可直接依據數學模型計算各因素與指標之間的數學關系，實現因素之間及因素與指標之間的定量分析。但二次回歸正交旋轉組合設計在植物組織培養研究中很少應用。

6-BA及NAA促進梨成熟胚子葉不定梢再生的研究已見報道，但僅局限于濃度組合優化，并沒有建立相應的數學模型。AgNO₃作為乙烯合成酶ACC的一種抑制劑，能抑制乙烯的生物合成，已日益成為植物子葉再生研究中不可或缺的一類外源添加劑。據報道，在一定濃度范圍內AgNO₃對梨子葉不定梢再生的促進作用可提高15％左右。我們擬將AgNO₃作為促進梨成熟胚子葉再生的重要因素之一，基于6-BA、NAA及AgNO₃濃度進行三因素二次回歸正交旋轉組合設計，通過建立數學模型進行預測預報，為梨成熟胚子葉不定梢再生研究提供規范化的數學方法。

1 材料和方法

1.1 取材和培養條件

供試材料以四川農業大學梨種質資源圃中水晶×金二十世紀花后90d的成熟胚子葉為外植體。無菌條件下剝開種子，取出成熟胚。將子葉從胚軸上剝離，橫切為近、遠軸兩部分，遠軸面接觸培養基，接種于附加不同濃度6-BA、NAA和AgNO₃的NN69培養基上(表1)。暗處理21d后，在溫度(25±1)℃，光照48001X，光周期(光照／黑暗)16h/8h條件下繼續培養。每隔28d繼代1次。

1.2 二次回歸正交旋轉組合設計試驗方案的擬定方法

1.2.1 二次回歸多項式方程的確立 試驗對6-BA濃度、NAA濃度及AgNO₃濃度3個因素進行篩選，因此建立三元二次回歸方程Y=B₀+B₁X₁+B₂X₂+B₃X₃+B₁₂X₁X₂+B₁₃X₁X₃+B₂₃X₂X₃+B₁₁X₁²+B₂₂X₂²+B₃₃X₃²(B₀為常數項；B₁、B₂、B₃為一次項回歸系數；B₁₂、B₁₃、B₂₃為交互項回歸系數；B₁₁、B₂₂、B₃₃分別為6-BA濃度、NAA濃度及AgNO₃濃度的二次方效應回歸系數)。

1.2.2 試驗各因素5水平及編碼值的確立根據本實驗室前期研究，確定6-BA為0-9mg·L^-1，NAA為0-1mg·L^-1，AgNO₃為0-5mg·L^-1在此范圍內，根據二次回歸正交旋轉組合設計，6-BA、NAA和AgNO₃濃度分別取5個水平，編碼值記為-r，-1，0，1，r，各因素變化區間記為△i，在零水平試驗組合設置9次

1.2.3 試驗方案的確定選用三因素二次回歸正交旋轉組合設計表(表2)。把6-BA濃度、NAA濃度、AgNO₃濃度編碼值分別安排在所選的設計表有關列上，表內的處理組合號即為試驗號。為估算回歸方程中的常數項B₀，在設計表的最前面添上一編碼值全為“1”的X₀列。在設計表的各因素X₁、X₂、X₃列下面均添加r和-r行。交互列X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃的編碼值分別為x₁與x₂、x₁與x₃、X₂與X₃之乘積。為了避免直接平方后使組合設計的正交性受到破壞，對二次項列X₁²和X₂²及X₃²的編碼值進行中心化處理，以中心編碼值X_j²代替平方項編碼值。

中心化處理公式：X_j²=X_j-1／N∑X_j²其中X_j為正交旋轉組合設計中各因素不同處理中的編碼值。

1.3 試驗數據采集

表2中X₁、X₂、X₃的編碼值分別是6-BA、NAA和AgNO₃各水平的編碼值，按表1中6-BA、NAA和AgNO₃各水平的實際用量進行不同濃度的組合配比試驗，其中試驗組合15-23為6-BA、NAA和AgNO₃零水平時的濃度組合，即9次重復。1-23號為23種組合的NN69基本培養基，水晶×金二十世紀的梨成熟胚子葉在培養基中培養56d時，統計接種外植體數、再生不定梢數，并計算再生系數(y=再生不定梢數，接種外植體數)，將這3項數據列于表2最后3列。

2 結果與分析

2.1 統計分析

根據采集的試驗數據(表2)計算各項回歸系數，以這些回歸系數建立三元二次回歸方程：y=3.4306+0.8638X₁-0.3869X₂-0.0584X₃-0.0157X₁X₂+0.0005X₁X₃+0.0112X₂X₃-0.6718X₁’-0.2192X₂’-0.7499X₃’。因為二次回歸正交旋轉組合設計的平方項x₁²、X₂²、x₃²的編碼值已經中心化處理，按原中心化處理的計算公式帶人上面的方程即得到另一形式的回歸方程表達式：Y=4.4053+0.8638X₁-0.3869X₂-0.0584X₃-0.0157X₁X₂+0.0005X₁X₃+0.0112X₂X₃-0.6718X₁²-0.2192X₂²-0.7499X₃²。由表3可知，純誤差平方和與失擬平方和的差異性檢驗未達顯著水平(F0.01)，說明回歸方程擬合良好，影響水晶×金二十世紀梨成熟胚子葉不定梢再生系數的主要因素均已考慮到，并可進一步進行顯著性檢驗。由表4可知，該回歸方程極顯著，表明所建立的數學模型可靠度高。同時，各項回歸系數的檢驗結果(表5)表明，一次項系數B₁達極顯著水平，B₂達顯著水平：交互項系數B₁₂、B₁₃、B₂₃均未達顯著水平；二次項系數B₁₁、B₃₃均達極顯著水平。表明試驗所考慮的3個因素均能(極)顯著地影響水晶×金二十世紀梨成熟胚子葉不定梢再生系數。該回歸方程的復決定系數R²=SS_回／SS_總=0.8585(表3)，說明6-BA、NAA、AgNO₃濃度對水晶×金二十世紀梨成熟胚子葉不定梢再生系數的影響達85.85％，僅有14.15％是由其他未控制因素和誤差造成的。

2.2 數學模型的解析與優化

2.2.1 單因素效應 由于二次回歸正交旋轉組合設計具有正交性，各變異來源之間相互獨立，所以可采用降維法將其他2個因素固定在0水平，得另一個因素的回歸子模型，這樣即可得到3個回歸子模型。Y₁=4.4053+0.8638X₁-0.6718X₁²；Y₂=4.4053-0.3869X₂-0.2192X₂²；Y3=4.4053-0.0584X₃-0.7499X₃²

根據這3個回歸子模型作圖(圖1)。由圖1可知，x₁(6-BA濃度)、x₂(NAA濃度)、X₃(AgNO₃濃度)在試驗所設濃度范圍內對子葉不定梢再生系數的影響均呈現出不同程度的“低促高抑”現象；不同之處在于。6-BA濃度曲線高峰出現在1水平(7.38mg·L^-1)，NAA濃度曲線高峰在-1水平(0.2mg·L^-1)，而AgNO₃濃度曲線高峰則出現在0水平(2.5mg·L^-1)。表明當其他兩因素固定在0水平時，以曲線高峰為基準，增加或減少某因素的使用量，都會不同程度地降低子葉不定梢再生系數。

2.2.2 模擬尋優 本試驗為3因素5水平，共有53=125個處理，將其代入回歸方程可得125個不定梢再生系數預測值，其中大于3的處理有39個，這39個處理在其相應各試驗因素取值分布的頻率見表6。由表6可知，當培養基中的6-BA、NAA、AgN03實際用量分別控制在5.955-7.124mg·L^-1，0.281-0.473mg·L^-1及2.199-2.801mg·L^-1時，可使不定梢再生系數大于3的可靠性達到95％。

3 討論

二次回歸正交旋轉組合設計是一種具有正交、回歸、旋轉和較高飽和程度的一種更高級的試驗設計方法。采用二次回歸正交旋轉組合設計可以使試驗工作量大幅度減少，但對試驗精度要求很高，因為其中一個試驗點實際上代表著一批試驗點，因此在試驗過程中應盡可能使試驗材料一致，同時溫度、濕度、光照和pH值等培養條件以及培養基也應基本保持一致，否則會造成試驗誤差過大，使獲得的數學模型不能反映客觀實際。

本試驗采用二次回歸正交旋轉組合設計建立了梨成熟胚子葉不定梢再生體系的數學模型：y=4.4053+0.8638X₁-0.3869X₂-0.0584X₃-0.0157X₁X₂+0.0005X₁X₃+0.0112X₂X₃-0.6718X₁²-0.2192X₂²-0.7499X₃²；得出當培養基中的6-BA、NAA、AgNO₃實際用量分別控制在5.955-7.124mg·L^-1、0.281～0.473mg·L^-1及2.199-2.801mg·L^-1時，在95％置信區間內可使不定梢再生系數大于3的預測結論。為驗證該模型及預測結論的可靠性，在NN69基本培養基中分別添加在95％置信范圍內隨機抽取的濃度組合：6-BA7.0mg·L^-1、NAA0.4mg-L^-1和AgNO₃2.4mg·L^-1，接種水晶×金二十世紀花后90d的成熟胚子葉(種子經沙藏處理)40個，在其他條件基本一致(按1.1)的情況下培養56d后，統計不定梢再生數為198個，平均再生系數4.95，增殖范圍在上述置信區間內，證明試驗所得的回歸模型是可靠的。

同時，孫清榮等目認為培養基中附加生長調節劑5mg·L^-16-BA和0.5mg·L^-1NAA能獲得最高的梨不定梢再生率，李秀梅等認為培養基中加入0-4mg·L^-1AgNO₃對梨子葉不定梢再生有促進作用，但濃度大于4mg·L^-1時抑制子葉不定梢再生。這與本研究結果基本一致。值得一提的是，本試驗得出的6-BA濃度遠大于李秀梅等采用的3mg·L^-1，推測其原因，一方面可能是基因型差異導致的，另一方面也可能是由于取材時間不同而導致胚休眠程度有所差異而引起的。