草莓果實發育過程中糖\\pH值及ABA水平變化趨勢

摘要：為了揭示草莓果實發育和成熟的生理機制，本研究以杜克拉草莓7個時期的果實為試材，分析果實發育過程中pH值、可溶性糖和ABA變化趨勢。結果表明，果實發育前期可溶性糖積累以葡萄糖和果糖為主，蔗糖很低；果實進入始熟和成熟，蔗糖分別有一次快速積累的過程，全紅時蔗糖含量是果糖和葡萄糖的1.25倍。以純白期pH值最低點為界，pH值先降后升的“V”型變化趨勢依次伴隨著果實的褪綠和著色。瘦果中和花托中ABA水平變化趨勢分別呈“W”和“N”型，前者的含量大約是后者的3倍。除了始紅期外，花托中ABA含量在整個草莓果實發育過程中呈上升趨勢。同葡萄糖和果糖相比，蔗糖的積累呈現了獨特的變化趨勢；瘦果中和花托中的ABA積累既有同步又有區別，2者之間相關性不顯著；花托中的可溶性糖和ABA水平之間存在著密切關系。

關鍵詞：草莓；果實發育；可溶性糖；pH值；脫落酸

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-72-05

果實的形成是植物一個獨特的發育過程，不僅涉及了人類食品、營養、健康，而且其成熟的調控也是果樹生產關注的核心問題。根據果實成熟的特點，果實可分為呼吸躍變和非呼吸躍變2個基本類型。多年來，人們圍繞躍變型果實開展了很多研究，其調控的生理及分子機制已基本闡明，但對非躍變型果實發育和成熟調控機制的了解卻相對貧乏。

草莓不僅栽培管理簡單，而且其果實營養豐富、生長期短(從開花到漿果成熟只需要1個月左右的時間)，因此，草莓果實是研究非呼吸躍變型果實理想的材料。為此，我們以溫室草莓杜克拉品種為試材，在觀測果實外觀顏色變化的基礎上，測定花后果實不同發育時期可溶性糖含量(蔗糖、葡萄糖和果糖)、pH值，及花托和瘦果ABA水平變化，并探討草莓果實糖、酸和ABA之間關系，為揭示草莓果實發育和成熟調控的生理機制奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗于2009年1～3月進行。試材為北京農學院科研基地溫室杜克拉草莓，草莓生長狀況良好。在草莓第1穗果開花時做標記，定期采果。試材大小一致，均為同期、發育一致、一級序果。

Fait等將草莓果實發育期劃分為7個時期：小綠(花后7d)、大綠(花后14d)、淺綠(花后18d)、純白(花后21d)、始紅(花后23d)、片紅(花后25d)、全紅(花后28d)(圖版-A-G)。隨機選取各期果實12個，瘦果和花托分離后分別用液氮速凍，并存于一80℃超低溫冰箱，供測試分析用。

1.2 方法

1.2.1 pH值測定 從-80℃超低溫冰箱中取出花托，設3次重復。每重復取3個果實，在每個果實中間部位，用打孔器取表皮下花托1g左右，混合研磨后取0.5g，加入10mL蒸餾水，研磨成勻漿，轉入50mL三角瓶。室溫放置2h，然后用DELTA320pH值計測定勻漿pH值，該值代表花托pH值。

1.2.2 可溶性糖測定 從-80℃超低溫冰箱中取出花托，設3次重復。每重復取3個果實，在每個果實中間部位，用打孔器取表皮下花托1g左右，混合研磨后取0.5g，加入10mL80％乙醇于80℃水浴3min，10000g離心10min，收集上清于100mL三角燒瓶中。渣滓用10mL80％乙醇于80℃水浴20min，10000g離心10min，重復2次，合并上清，剩余渣滓用80％乙醇1mL洗滌過濾，濾液移入10mL試管中加2滴5％α-萘酚，混勻后，沿管壁緩緩加入濃硫酸，分層處無紫色環出現說明樣品中的糖被完全抽提。合并后的上清在沸水中蒸干，用20mL超純水洗2次，定容到50mL，取2mL過LC-18固相萃取柱，棄去最初1mL，收集后面的1mL過0.45μm濾膜，上機。

色譜條件為：美國安捷倫公司高效液相色譜儀Agilent Technologies 1200 Series，6.5×300 mm Sugar-Pak^TM-1柱(Waters公司)，化學工作站版本為B.02.01-SR2，流動相為超純水，流速0.400mL·min^-1，柱溫60.0℃，示差折光檢測器，檢測器溫度：50.0℃，進樣量20μL。所用標樣葡萄糖D-(+)Glucose、果糖D-(-)-Fructose、蔗糖Sucrose均購自Sigma公司。

測定結果回收率分別為葡萄糖90.61％、果糖86.30％和蔗糖97.61％。

1.2.3 脫落酸測定 從-80℃超低溫冰箱中分別取出花托和瘦果，設3次重復。每重復取3個果實及其種子，在每個果實中間部位，用打孔器取表皮下花托1g左右，混合研磨后取0.5g，瘦果混合研磨后取0.1g。用酶聯免疫法分別測定花托和瘦果中的脫落酸含量。

2 結果與分析

2.1 草莓花托中pH值變化

草莓果實中的酸主要為有機酸。pH值與果實中酸的含量有關。如圖1所示，在從小綠果發育為純白果的過程中，pH值快速持續降低，純白期值降至最低。此后，隨著果實逐漸變紅，pH值又持續上升，全紅時升至最高。

從pH值在整個果實發育過程中變化看出。草莓果實發育明顯分為2個階段。第一階段：伴隨pH值降低，果實逐漸增大、褪綠；第二階段：伴隨pH值上升，果實逐漸增大、變紅。這種變化特點在一定程度上表明了草莓果實發育過程存在2個明顯不同的生理階段。

2.2 草莓花托中可溶性糖含量變化

草莓果實中的可溶性糖主要為蔗糖、葡萄糖和果糖。從糖的變化趨勢來看，除了始紅期外，在草莓果實發育過程中可溶性糖含量呈上升趨勢，明顯存在2次持續上升的階段。第1階段：從小綠果至純白果，3種糖含量先緩慢增加，增加量以葡萄糖和果糖為主，隨后3者都快速增加，增加量以蔗糖最快：第2階段：從始紅果至全紅果，3種糖含量都快速增加，但仍以蔗糖增加最快。從糖的含量來看，從小綠果至淺綠果，果糖和葡萄糖平均含量分別是蔗糖的2.28倍和1.99倍；純白果3種糖含量相近：全紅果蔗糖含量最高，蔗糖平均含量是果糖和葡萄糖的1.25倍(圖2)。

從圖2還可以看出，在草莓果實整個發育過程中可溶性糖含量還存在2個引人關注的特征，(1)在第一、第二2個上升階段間，還存在一個快速而短期的下降階段(1～2d)，即從純白果至始紅果期；(2)變白和全紅之前蔗糖含量均急劇上升。

2.3 花托和瘦果中脫落酸水平變化

由于瘦果很小，尤其在草莓果實發育早期，很難從花托中分離出來并加以測定。前人測定草莓果實中脫落酸的含量主要集中在花托。為了比較分析瘦果和花托中ABA含量的變化，作者對2者進行了同時測定。

結果表明，在草莓果實發育過程中，瘦果中A-BA水平遠遠大于花托中ABA水平，前者平均含量是后者的3倍，而且2者變化趨勢也不一樣。具體來說，瘦果ABA水平變化趨勢呈“W型”，即有3個峰值和3個峰谷。3個峰值分別在小綠果、始紅果、全紅果，其中始紅果ABA水平最高，其次為全紅果。2個峰谷分別在大綠果和片紅果，片紅果水平略高于大綠果。花托中ABA水平變化趨勢基本呈“N型”，在小綠果時最低；隨后開始快速上升，在純白果時達到第1個高峰；從純白開始，ABA水平先快速下降，隨后又持續升高，全紅時達到最高(圖3)。總之，在杜克拉草莓果實發育過程中，瘦果和花托中的ABA積累變化趨勢既有同步又有區別。

2.4 草莓花托中ABA含量同其他生理指標變化相關性分析

表1為花托中ABA含量分別與pH值、可溶性糖及瘦果中ABA變化相關性分析，結果表明，ABA含量與蔗糖、葡萄糖和果糖含量之間的相關系數(r)分別為0.92、0.94、0.95，表明ABA與可溶性糖之間相關性極為顯著；ABA與花托中pH值和瘦果中A-BA變化相關系數分別為0.23、0.31，表明ABA與2者之間相關性不顯著。總之，花托中ABA水平與可溶性糖含量間存在密切關系，而與pH值和瘦果中ABA關系不大。

3 討論

3.1 花托和瘦果中的ABA可能具有不同的生理功能

前人證實，ABA在許多植物種子發育過程中發揮著重要作用：在擬南芥莢果發育過程中，種子內ABA不斷積累，促進種子休眠和增強種子對干旱耐受能力的作用；在玉米ABA合成缺陷型突變體種子內，ABA含量顯著低于野生型植株，種子胚不能正常休眠，呈現了提早萌發的特點；馬鴻翔等在研究草莓瘦果成熟度對種子發芽影響的試驗中發現，碩香品種花后7d、14d、21d、28d種子(瘦果)離體培養發芽率分別6.88％、24.12％、98.80％、100％，不但表明草莓瘦果越接近成熟發芽率越高，而且花后21d發芽率高達98.80％，從生理學角度花后21d的種子(瘦果)已經完成生理成熟。結合我們研究結果分析，杜克拉草莓瘦果中的ABA在成熟前5d始紅期達到高峰，而花托中的ABA在成熟期達到高峰，因此推測，在一定程度上草莓瘦果中ABA高峰可能是種子完成生理成熟的標志，而花托中ABA高峰可能是草莓果實成熟的生理標志。

花托和瘦果中ABA水平間的關系是一個非常值得關注的問題。從杜克拉草莓花托和瘦果中ABA水平分析結果表明，2者既有相同的變化趨勢(從大綠至純白及片紅至全紅)，又有相反的變化趨勢(小綠至大綠及純白至片紅，而且瘦果中ABA含量遠大于花托中ABA含量。在一定程度上花托中的ABA是否來自瘦果?但從花托和瘦果中ABA含量之間極低的相關系數來看，上述問題難以得出肯定的結論。從植物世代交替角度，花托要為種子提供良好的營養條件，2者相互協調，最終完成種子成熟的這一核心生物學事件。因此我們推測，瘦果中3次ABA高峰可能分別與果實坐果及種子生理成熟和后熟有關：花托中2次ABA高峰可能分別與果實褪綠和著色有關。

3.2 蔗糖與草莓果實成熟的關系

糖的運輸和分配是果實發育的物質基礎，是決定作物產量和品質的重要因素。本試驗結果表明，在杜克拉草莓果實發育早期，蔗糖含量比較低，這與果實中卸載的蔗糖迅速被轉化酶分解為葡萄糖和果糖代謝有關，并且蔗糖濃度梯度能促進光合產物向果實運輸。在杜克拉草莓果實發育中、后期，隨著蔗糖2次含量急劇升高，果實很快進入白熟期和成熟期，這在一定程度上揭示了蔗糖在草莓果實發育成熟過程中發揮著重要的作用。另外，我們對大綠期果實表面涂抹5μmol·L^-1蔗糖后，可以使草莓果個增加約20％，提前2-3d成熟(數據未列出)，表明蔗糖積累與草莓果實成熟關系密切。

在草莓中，蔗糖是“源一庫”間光合同化物的主要運輸形式。前人研究表明，蔗糖在植物細胞間的運輸有2種途徑：通過胞間連絲進行的共質體途徑和通過細胞間隙進行運輸的質外體途徑，質外體途徑中需要通過載體將糖裝載人細胞。Zhang等研究發現，在葡萄果實發育中前期當可溶性糖的積累水平很低時，果實內韌皮部卸載采取共質體途徑；當果實發育進入成熟期，可溶糖迅猛升高時，韌皮部卸載路徑適應性地轉換為質外體路徑。從共質體路徑轉換為質外體路徑的轉折點在所謂的“始熟期”，也是葡萄果實從前期成長到后期成熟的發育轉折期。Ruan等證實，隨著番茄果實的成熟，果肉細胞間的胞間連絲逐漸消失。因此，在杜克拉草莓果實進入成熟過程中，蔗糖含量急劇升高的調控機制有待今后通過細胞生物學和分子生物學手段進一步確定。

4 結論

在杜克拉草莓果實發育過程中，顏色和pH值變化揭示了褪綠和著色是2個獨特的生理階段；同葡萄糖和果糖相比，蔗糖的積累呈現了獨特的變化趨勢：瘦果中和花托中的ABA積累既有同步又有區別，2者之間相關性不顯著；花托中的可溶性糖與ABA水平之間有著密切的關系。