柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase的生化毒理學特性研究

摘要：為明確柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase與其抗藥性之間的關系，采用微量滴度酶標板法對柑橘全爪螨敏感品系(SS)、甲氰菊酯抗性品系(FeR)和阿維菌素抗性品系(AvR)的Na⁺-K⁺-ATPase的生化毒理學特性進行了比較研究。結果表明，柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase比活力從高到低依次為AvR、SS和FeR；柑橘全爪螨FeR的Na⁺-K⁺-ATPase的動力學參數Km和Vmax值均顯著高于AvR和SS，AvR的Na⁺-K⁺-ATPase的Vmax值也顯著高于SS。離體抑制作用測定結果表明，柑橘全爪螨3個品系Na⁺-K⁺-ATPase的活力均受到甲氰菊酯不同程度的抑制，其中對SS的抑制作用最強，其次為AvR，而對FeR的抑制作用顯著弱于前2個品系；阿維菌素對柑橘全爪螨3個品系Na⁺-K⁺-ATPase的活力也有一定的抑制作用，在供試濃度范圍(0.0229～2290.7146μmol-L^-1)內抑制率僅為3.60％-12.76％。結果表明，柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase活力降低及其對藥劑敏感性下降是其對甲氰菊酯產生抗性的重要原因，Na⁺-K⁺-ATPase活性的提高可能與阿維菌素抗性形成有一定的關系。

關鍵詞：柑橘全爪螨；Na⁺-K⁺-ATPase；甲氰菊酯；阿維菌素：抗性

中圖分類號：S666 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-102-06

三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase，AT-Pase；EC3.6.1.3)廣泛分布于細胞膜上，是為主動運輸提供能量的專一性酶。ATPase能將ATP水解成二磷酸腺苷(ADP)和無機磷(Pi)，同時釋放能量，此時ATPase構象發生變化，使離子轉運，并將物質逆著濃度梯度進行運輸。因此，ATPase對于維持細胞膜內外離子濃度梯度有著非常重要的作用。常見的ATPase主要包括3大類：即Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase和H⁺-ATPase。其中，Na⁺-K⁺-ATPase是ATPase中最重要、也是研究最多的一種水解酶類。它依賴于鈉、鉀三磷酸腺苷的酶，廣泛分布于各類細胞，在可興奮細胞中的神經突觸質膜上含量尤為豐富。Na⁺-K⁺-ATPase為神經突觸體的標記酶，其基本功能是催化ATP末端磷酸化水解，并利用ATP末端磷酸化水解反應產生的自由能逆化學梯度進行Na⁺、K⁺的主動運輸，從而維持了細胞膜內外的Na⁺、K⁺離子濃度的相對恒定及滲透壓的平衡，進而保證了細胞正常的神經傳導、物質吸收等重要的生理功能。此外，Na⁺-K⁺-ATPase在無ATP供給能量時，還具有Na⁺、K⁺等離子通道的作用。

目前，在動植物方面均有關于ATPase特性及應用的研究。研究表明，Na⁺-K⁺-ATPase在昆蟲抗藥性形成中起著不可忽視的作用㈣，擬除蟲菊酯類殺蟲劑和DDT的毒理機制與昆蟲神經系統中Na⁺-K⁺-ATPase有密切的關系，多種殺蟲劑對昆蟲Na⁺-K⁺-ATPase活力亦有一定的抑制作用。柑橘全爪螨Panonychus citri(MeGegor)作為一種世界性的多食性害螨，由于其活動范圍小，發育周期短，世代多，產卵量大且卵突變率高，在一定范圍內受藥劑選擇淘汰作用機會相對較多，抗性因子積累相對較快，造成該螨抗藥性產生極為迅速，對甲氰菊酯、噠螨酮等常用藥劑一年內就可產生5.1、2.2倍的抗性。因此，對柑橘全爪螨抗性機理的研究顯得非常迫切。為此，本文參照馮北元等和程偉霞的研究方法比較研究了柑橘全爪螨不同品系Na⁺-K⁺-ATPase的活性、動力學常數以及2種殺螨劑對其活力的抑制作用，旨在分析柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase的生化毒理學特性及其在抗藥性形成中的作用，進一步豐富Na⁺-K⁺-ATPase的研究內容，并為柑橘全爪螨的綜合防治及其抗性治理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試螨源

柑橘全爪螨敏感品系(SS)自2007年10月采于重慶北碚歇馬柑桔研究所柑桔資源圃內，至少10a未用藥，采回后移接到人工氣候室內盆栽枳殼苗上隔離飼養：分別從敏感品系中分出一部分螨源培育抗性品系。培育時用小型噴霧器噴施藥液，選擇壓力保持在50％-70％的死亡率。存活個體繼續飼養，累代連續處理存活個體的子代，每隔幾代測定1次LCso值。甲氰菊酯抗性品系(FeR)和阿維菌素抗性品系(AvR)分別經敏感品系不連續汰選16代和11代獲得。

1.2 主要供試藥劑

甲氰菊酯(Fenpropathrin，92％原藥)和阿維菌素(Avermectin，10.81％原藥)(四川省農藥檢定所提供)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，香港Farco公司)；烏本苷(Ouabain)和考馬斯亮藍G-250(Fluka ChemicCo.產品)；咪唑(Imidazole，Amersco公司)；ATP二鈉鹽(sigma公司)，三氯乙酸(TCA，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司；乙二胺四乙酸(EDTA，上海試劑一廠)。

1.3 生物測定

生物測定參照聯合國糧農組織(FAO)推薦的害螨生物測定的標準方法一玻片浸漬法。將雙面膠帶剪成2cm長貼在載玻片的一端，用毛筆挑選健康雌成螨，將其背部黏在載玻片的雙面膠帶上，每塊載玻片40頭。通過預備試驗，在柑橘全爪螨死亡率15％-90％按等比或等差級數將藥劑稀釋成5個濃度，將玻片帶螨的一端浸入藥液中，輕輕搖動5s后取出，迅速用吸水紙吸干螨體及其周圍多余的藥液，室溫晾干后置于溫度為(25±1)℃、RH=75％左右的光照培養箱中，24h(阿維菌素為48h)后于雙筒解剖鏡下觀察死亡螨數并作記錄。以清水為對照，對照組死亡率在10％以下視為有效試驗，重復3次。所得數據在SPSS12.0for Windows軟件上進行處理，求出毒力回歸直線方程和致死中濃度LC₅₀值。將敏感品系與抗性品系所得的LC₅₀值進行比較，得到其相對抗性倍數。

1.4 酶源制備

參照程偉霞的方法，略有改進。挑取柑橘全爪螨雌成螨100頭，加入1.0mL勻漿液(含0.1mol·L^-1·Tris、1mmol-L^-1 EDTA、0.25 mol·L^-1蔗糖、10mmol·L^-1咪唑)在冰水浴中勻漿，4℃、3000r·min^-1離心30min，取上清液作酶源備用。酶源蛋白含量按Bradford方法進行。

1.5 Na⁺-K⁺-ATPase活力測定

參照馮北元等方法，利用含100nmol·mE^-1無機磷(Pi)的KH₂PO₄溶液制作標準曲線。取300μL反應液于酶標儀(奧地利TECAN公司)625nm處測OD值。

活力測定參照馮北元等、何運轉等方法。反應總體積為100μL，分2組同時進行，每組反應體系中均含有50mmol·L^-1Tris-HCl、10-12μg蛋白質酶液、5mmol·L^-1MgCl₂。不同之處為：Ⅰ組含有160mmo]·L^-1NaCl、20mmol·L^-1KCl；Ⅱ組含有0.5mmol·L-1²Ouabain。在37℃預保溫5min，加底物ATP(在反應體系中的濃度為0.5mmol-L^-1)，于37℃反應5min，加50μL質量分數為15％的三氯乙酸終止反應。染色完成后取300μL反應液于625nm處測OD值，求出反應中生成的無機磷的量，計算ATP酶活力。每組重復3次。組Ⅰ和組Ⅱ的OD值之差查標準曲線得出Pi的量，換算成活力單位：nm01·(mite)^-1，rain^-1或比活單位：nmol·mg^-1·rain^-1。

1.6 ATPase動力學參數墨K_m和V_max的測定

改變底物ATP的濃度，其最終反應濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol·L^-1，其余同AT-Pase活力測定。采用雙倒數作圖法計算獲得K_m和V_max。

1.7 2種殺螨劑對Na⁺-K⁺-ATPase活力的抑制作用

將甲氰菊酯和阿維菌素用丙酮配成一定濃度的母液，試驗前用去離子水稀釋至所需的一系列濃度(甲氰菊酯為0.0263-2632.8592μmol·L^-1：阿維菌素為0.0229-2290.7146μmol·L^-1)。ATP酶活力測定反應體系同上，分別加入10μL不同濃度的殺螨劑于酶液中混合，37℃保溫5min后再加入ATP反應。以不加殺螨劑的丙酮水溶液(丙酮<1％)為對照。ATP酶活力測定與計算方法同上。

2 結果與分析

2.1 柑橘全爪螨生物測定結果

抗性選育結果表明，利用甲氰菊酯、阿維菌素分別不連續汰選16代和11代后，柑橘全爪螨對2者的抗性分別達到29.92和3.80倍。說明柑橘全爪螨對甲氰菊酯和阿維菌素均能產生一定程度的抗性，但抗性倍數在2種殺螨劑問差異較大(表1)。

2.2 柑橘全爪螨不同品系Na⁺-K⁺-ATPase活力和動力學常數比較

柑橘全爪螨3個品系Na⁺-K⁺-ATPase活力和動力學參數見表2。由表2可以看出，柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase的活力和比活力從高到低順序為AvR>SS>FeR，表明在殺螨劑的長期選擇作用下ATPase發生了改變。其中，在甲氰菊酯選擇作用下Na⁺-K⁺-ATPase活力和比活力顯著降低(P<0.05)，而在阿維菌素的選擇壓力下，柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase活力升高，但與敏感品系間差異不顯著(P>0.05)。

酶動力學分析結果表明，柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性品系體內Na⁺-K⁺-ATPase的k_m和y_max值與敏感品系相比增大，分別是敏感品系的1.78倍與1.32倍，且差異顯著(P<0.05，表2)；說明柑橘全爪螨在甲氰菊酯的選擇壓力下，其Na⁺-K⁺-ATPase對底物的親和力減小，催化活性增強，不僅發生了量變，同時發生了質變。而阿維菌素抗性品系Na⁺-K⁺-AT-Pase的K_m和V_max值也高于敏感品系，但僅V_max值與敏感品系相比差異顯著(P<0.05，表2)；說明阿維菌素作用于柑橘全爪螨后其Na⁺-K⁺-ATPase對底物親和力有一定的減小，催化活性也有所增強，但尚未發生明顯的質變。

2.3 甲氰菊酯和阿維菌素對柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase的離體抑制作用

離體抑制作用測定結果表明，在供試的6個甲氰菊酯濃度作用下，柑橘全爪螨3個品系Na⁺-K⁺-AT—Pase比活力均受到了不同程度的抑制；其中對敏感品系的抑制作用最強，其次為阿維菌素抗性品系，對甲氰菊酯抗性品系的抑制作用最弱；且甲氰菊酯抗性品系與其他2個品系之間差異顯著(P<0.05，圖1)。

阿維菌素對柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase的比活力也有一定的抑制作用，抑制率隨著藥劑濃度的升高而增大。在供試濃度范圍(O.0229-2290.7146μmol·L^-1)內抑制率在3.60％-12.76％(圖1)。就3個不同品系比較而言，阿維菌素對2個抗性品系Na⁺-K⁺-ATPase的抑制作用較弱，在較高濃度下(229.0715和2290.7146μmol·L^-1)與敏感品系間差異顯著(P<0.05，圖1)。

3 討論

Na⁺-K⁺-ATPase起主動運輸Na⁺、K⁺的作用，與鈉離子通道密切相關，是擬除蟲菊酯殺蟲(螨)劑的靶標位點之一。抗性昆蟲的Na⁺-K⁺-ATPase通常表現為對該類殺蟲劑的敏感性降低或不敏感。通過對家蠅敏感、抗氯菊酯和抗溴氰菊酯品系神經系統Na⁺-K⁺-ATPase研究發現，3個品系間酶比活力雖無顯著差異，但溴氰菊酯和氯氰菊酯對家蠅的Na⁺-K⁺-ATPase的抑制作用在敏感和抗性品系間存在顯著差異；2種藥劑對敏感品系Na⁺-K⁺-ATPase的活力有明顯抑制作用，表明抗性品系的Na⁺-K⁺-ATPase對這2種藥劑的敏感性顯著降低。不同濃度溴氰菊酯對家蠅敏感和抗性品系突觸膜上的Na⁺-K⁺-ATPase和Ca2+-ATPase的研究表明，溴氰菊酯對2種酶活力均有一定的抑制作用，且對敏感品系的抑制作用顯著高于抗性品系。此外，甜菜夜蛾Spodopteraexigua敏感和高效氯氟氰菊酯品系神經系統AT-Pase研究發現，敏感和抗性品系的Na⁺-K⁺-ATPase活力差異不顯著，但離體抑制作用結果表明高效氯氰菊酯對敏感品系Na⁺-K⁺-ATPase抑制作用明顯強于抗性品系，說明甜菜夜蛾抗性品系Na⁺-K⁺-ATPase對高效氯氰菊酯的敏感性降低，推測這可能是其產生抗性的原因之一㈣。本研究結果表明。柑橘全爪螨3個品系間ATPase活力及動力學常數均有一定的差異。其中，甲氰菊酯抗性品系Na⁺-K⁺-ATPase比活力顯著低于敏感品系，米氏常數K_m顯著高于敏感品系，表明柑橘全爪螨對甲氰菊酯抗性與Na⁺-K⁺-AT-Pase有一定的相關性，活力的顯著降低表明該抗性品系的Na⁺通道數目減少，這與米氏常數K_m值增大結果一致；此外，離體抑制作用表明，甲氰菊酯對柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase有一定的抑制作用，且對敏感品系的抑制作用顯著強于甲氰菊酯抗性品系，說明柑橘全爪螨抗性品系Na⁺-K⁺-ATPase對甲氰菊酯敏感性顯著降低。這些結果與前人對昆蟲的研究結果類似，說明葉螨對擬除蟲菊酯類殺螨劑的抗性機理可能與昆蟲類似。此外有研究表明，葉螨Te-tranychus truncotus對甲氰菊酯的抗性與其鈉離子通道發生突變有關㈣。柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性品系的鈉離子通道是否也發生了突變還有待于進一步的研究。

擬除蟲菊酯類藥劑對昆蟲Na⁺-K⁺-ATPase有較強的抑制作用，而這可能是該類藥劑毒理機制的一部分，至少表明其在軸突的傳導上有間接的影響效應。除擬除蟲菊酯類殺蟲劑外，一些有機氯、有機磷、氨基甲酸酯類以及植物源殺蟲劑等對昆蟲的Na⁺-K⁺-ATPase也具有抑制作用。有機氯殺蟲劑硫丹對二化螟Na⁺-K⁺-ATPase具有一定抑制作用；辛硫磷、馬拉硫磷對家蠅ATPase具有一定的抑制作用㈣；甲胺磷、三唑磷和呋喃丹對二化螟ATPase具有一定的抑制作用㈣；松油烯-4-醇對粘蟲Mythimna separata、家蠅以及庫蚊Culex pip-ieus等昆蟲的Na⁺-K⁺-ATPase具有明顯的抑制作用。此外，研究也發現，典型光活化毒素α-三噻吩對亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis和棉鈴蟲Heliothis armigera Na⁺-K⁺-ATPase具有抑制作用，昆蟲生長調節劑(具保幼激素活性)對亞洲玉米螟Na⁺-K⁺-ATPase也具有一定的抑制作用。本研究發現，生物源殺蟲(螨)劑阿維菌素對柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase有一定的抑制作用。與敏感品系相比，柑橘全爪螨阿維菌素抗性品系的Na⁺-K⁺-ATPase活力和比活力都有一定程度的提高，米氏常數K_m和最大反應速度V_max值也有一定的變化，說明柑橘全爪螨Na⁺-K⁺-ATPase在阿維菌素抗性品系的形成中具有一定的作用，但從影響結果來看阿維菌素與擬除蟲菊酯類殺蟲(螨)劑作用機理不同，具體差異還有待于進一步的研究。

總之，柑橘全爪螨對甲氰菊酯的抗性風險較高，對阿維菌素亦存在一定的抗性風險。重慶地區柑橘全爪螨防治藥劑施用調查以及抗性監測結果表明，柑橘全爪螨對近年來常用的甲氰菊酯和噠螨酮的抗藥性發展速度非常快，且與其他類型農藥有明顯的交互抗性，在生產中應當避免擬除蟲菊酯或噠螨酮等農藥的連續單一使用，以延緩其抗性的產生。