珠美海棠葉片離體培養與植株再生

摘要：將珠美海棠試管苗葉片接種于附加NAA0.3mg·L^-1和不同體積分數的6-BA(1.0-6.0mg·L^-1)的MS培養基中進行離體培養，結果表明，6-BA為1.0-3.0mg·L^-1的處理芽再生率為6.7％-31.8％，而根的再生率為26.7％-28.3％。6-BA為4.5和6.0mg·L^-1處理芽再生率分別高達80.0％和60.0％，根的再生率小于5％。繼代培養60d的珠美海棠試管苗葉片的芽再生率顯著低于繼代培養30d的葉片。采用橫切主脈的葉片切傷方式，其切口處芽的再生率及整個葉片芽的再生率均顯著高于縱切主脈兩側葉片、橫切主脈兩側葉片及橫剪主脈兩側葉片等切傷方式。

關鍵詞：珠美海棠；葉片；離體培養；再生

中圖分類號：$661.19 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-124-05

珠美海棠(Mslus zumi)為蘋果屬落葉小喬木或灌木，原產于日本北部山區，是毛山定子和三葉海棠的野生雜交種，1976年引入我國，具有較強的抗逆能力，抗白粉病和黑星病，較耐澇，并具有很強的耐鹽能力，在含鹽量0.4％左右的土壤中能夠正常生長與開花結果，可以作為鹽漬地區的綠化樹種和蘋果砧木推廣應用。利用珠美海棠的耐鹽特性進行轉基因耐鹽植物的培育具有廣闊前景。蘋果葉片的間隙大，易由細胞誘導分化出不定芽，已被作為基因轉移操作及體細胞誘變的理想受體材料，因此建立葉片離體高效再生體系就成為進行蘋果遺傳操作的一個重要環節。目前對蘋果品種與砧木的葉片培養與植株再生已有許多研究，而對珠美海棠葉片培養的報道較少。李寶等探討了不同氮源和碳源對珠美海棠葉片再生效果的影響，并認為培養基中的6-BA和NAA組合為2.5mg·L^-1：0.25mg·L^-1時的葉片再生效果最好，王艷等的研究結果則表明這一激素組合為3.0mg·L^-1：0.3mg·L^-1時葉片再生最好，2者雖然接近，但存在差異。從已有的研究看，蘋果葉片培養的再生效果受培養基成分、外植體生理狀態、接種方式及培養方式等多種因素的影響，從而影響到試驗結果的重現性。因此，有必要從多方面深入探討影響珠美海棠葉片培養的因素，以便為建立高效、穩定的珠美海棠葉片培養再生體系提供依據。

1 材料和方法

以在附加6-BA0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1的MS培養基上繼代培養的珠美海棠試管苗為試材，以附加30g·L^-1蔗糖的MS培養基為基本培養基。

1.1 不同體積分數的6-BA和NAA組合對珠美海棠葉片培養與植株再生的影響

在基本培養基中分別添加NAA0.3mg·L^-1與不同體積分數的6-BA構成不同的激素組合，6-BA體積分數分別為1.0、2.0、3.0、4.5和6.0mg·L^-1，培養基pH值調至5.9，用7.2g·L^-1瓊脂做培養基固化劑。在50mL三角瓶中加入25mL培養基，用棉塞封口，在0.11-0.12Mpa的壓力下滅菌20min。

選用繼代培養30d的珠美海棠試管苗為試材，并選擇試管苗頂部1-4片展開葉接種。接種時先用剪刀垂直于主葉脈將葉片兩側各剪成2-3個剪口，剪口深至接近主脈，然后將葉片自葉柄剪下，葉背面朝下平鋪于培養基表面。每個處理接種20個葉片為1次重復，重復3次。接種后在24.6-25.7℃下暗培養20d，然后在光強3000-4000lx、光周期14h／d、23-27℃條件下培養。培養14d后調查各處理愈傷組織發生狀況，培養40d后調查各處理器官再生情況。調查指標中的芽(根)再生率等于再生芽(根)的葉片數與接種葉片數之比，再生芽(根)數等于再生芽(根)總數與再生芽(根)的葉片數之比。

1.2 試管苗繼代培養時間對珠美海棠葉片培養中植株再生的影響

選擇繼代培養60d的珠美海棠試管苗葉片，接種于附加NAA0.3mg·L^-1、6-BA4.5mg·L^-1及蔗糖30g·L^-1的MS培養基中，并以繼代培養30d時剪取的珠美海棠葉片做對照。培養基滅菌方法、葉片剪取與接種方式均同試驗1.1，每處理接種20枚葉片為1次重復，重復3次。接種后進行暗培養20d，而后轉入光下培養20d，暗培養及光培養條件同試驗1.1。暗培養與光培養結束后調查芽再生率與再生芽數，指標計算方法同前。

1.3 葉片切傷方式對葉片再生能力的影響

以繼代培養30d的珠美海棠試管苗葉片為試材，接種于附加NAA0.3mg·L^-1、6-BA4.5mg·L^-1及蔗糖30g·L^-1的MS培養基中。接種時葉片的切傷方式設計為4種。橫切主脈：在葉片主脈上橫切3-4個切口；縱切兩側：在葉片主脈兩側葉片處縱切3-4個切口，不切斷葉緣：橫切兩側：在葉片主脈兩側葉片處橫切3-4個切口，不切斷葉緣：橫剪兩側：用剪刀在葉片主脈兩側葉片處橫剪3～4個剪口，并剪斷葉緣。上述每處理每次重復至少接種16枚葉片，重復3次。接種后進行暗培養20d，而后轉入光下培養20d，暗培養及光培養條件同試驗1.1。暗培養與光培養結束后調查芽再生率與再生芽數，指標計算方法同前。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的6-BA和NAA組合對珠美海棠葉片愈傷組織誘導與植株再生的影響

接種后1周即有愈傷組織發生，接種2周時愈傷組織發生率各處理均達100％(表1，圖版-A)。暗培養結束后，在剪口處的愈傷組織中即分化出了芽或根，葉柄部位的愈傷組織較少有器官分化。

不同濃度的6-BA和NAA組合對珠美海棠葉片培養再生器官的類型和再生頻率有顯著的影響(表l，圖版B)。在培養基中NAA體積分數為0.3mg·L^-1不變的條件下，較低的6-BA體積分數(1.0和2.0mg·L^-1)處理中芽的再生率很低，均小于15％，而根的再生率較高，為26.7％-28.3％。隨6-BA體積分數增高，芽的再生率明顯增高而根的再生率顯著下降，在6-BA體積分數為4.5mg·L^-1時芽再生率最高為80.0％，6-BA體積分數至6.0mg·L^-1時又下降至60.0％，這2個處理中根的再生率則顯著降至5％以下。6-BA體積分數為3.0mg·L^-1時根的再生率也較高，與6-BA體積分數1.0和2.0mg·L^-1處理無明顯差異，前者的芽再生率雖然較后2者有明顯提高，但顯著低于6-BA體積分數為4.5和6.0mg·L^-1的處理。

葉片培養中再生的芽接人含有6-BA版0.5mg·L^-1的MS培養基中可形成叢生芽(圖版-C)，接入含有0.5mg·L^-1 IBA的大量元素減半的MS培養基中即可生根，形成完整植株(圖版D)，然后將其-移栽入土并成活(圖版-E)。

2.2 試管苗繼代培養時間對珠美海棠葉片培養植株再生的影響

由表2可見，不同的繼代培養時間對珠美海棠試管苗葉片的再生能力有明顯的影響，繼代培養60d的珠美海棠葉片的芽再生頻率明顯低于繼代培養30d的葉片。

2.3 葉片切傷方式對其再生能力的影響

由表3可見，對珠美海棠葉片采用不同的切傷方式，切口處不定芽的再生頻率存在差異。其中以橫切主脈的處理切口處芽的再生率最高，并顯著高于后面3個處理，后3個處理差異不顯著。各處理葉柄殘余部位也均有芽的再生，其中以橫剪兩側的處理葉柄部位芽的再生率顯著低于前面3個處理，前3個處理之間差異不顯著。由于橫切主脈處理切口處芽再生率顯著高于其他處理，也就導致了整個葉片的芽再生率也以橫切主脈為最高，并顯著高于其他處理。

3 討論

一般來說，細胞分裂素和生長素的比率決定著器官分化的類型，當細胞分裂素占優勢時有利于芽的分化，當生長素占優勢時有利于根的分化。研究結果驗證了這一規律，當培養基中NAA濃度保持0.3mg·L^-1不變時，較低濃度(1.0和2.0mg·L^-1)的6-BA處理主要誘導出根器官，較高濃度(4.5和6.0mg·L^-1)的6-BA處理主要誘導出芽器官，并且在6-BA濃度為4.5mg·L^-1時芽的再生率最大，為80％。

在蘋果葉片直接誘導再生不定芽的試驗中，大部分采用了高濃度細胞分裂素(BA2.5-10mg-L^-1)與低濃度生長素配比作為誘導葉片再生的激素組合，在生長素中NAA被許多研究者采用，濃度在0.2-1mg-L^-1不等，也有用NAA3mg·L^-1的組合。據李寶等報道，在6-BA濃度為2.5mg·L^-1、NAA濃度為0.25mg-L^-1的條件下，珠美海棠葉片培養中芽的再生率最高達96.7％，而王艷等報道。在6-BA濃度為3.0mg·L^-1、NAA濃度為0.3mg·L^-1的條件下，珠美海棠葉片培養中芽的再生率最高為90％，這兩項研究中均未報道有根的分化。本文中，在6-BA濃度為4.5mg·L^-1、NAA濃度為0.3mg，L^-1時珠美海棠葉片的芽再生率最高為80％，而在6-BA濃度為3.0mg·L^-1、NAA濃度為0.3mg·L^-1的激素組合中，芽的再生率只有31.8％，而且根的再生率高達28.3％。Dobranszki等㈣曾研究了一種新型芳香族細胞激動素meta-topolin對嘎拉蘋果葉片形態學和組織學的影響，以及對這些葉片再生能力的后續作用，結果表明在不同濃度的meta-topolin培養基中形成的葉片再生能力明顯不同。研究與李寶等、王艷等的報道不一致的原因可能是所用試材的繼代培養基和繼代次數存在差異，由于試管苗所用繼代培養基與繼代次數不同，可能導致試管苗自身的激素水平出現差異，進而對其葉片再生能力產生后續作用。培養基所使用的碳源不同，可能也是影響植物激素對葉片再生效果的因素之一。對此尚待進一步的研究。

葉片培養中所用葉片的著生部位、葉片幼嫩或老熟、葉片大小及葉片所屬試管苗的繼代培養時間等都對其再分化能力有顯著影響。張玉萍等在蘋果葉片培養中發現，近莖尖處的上位葉再分化率較高而下位葉較低：李艷紅等對蘋果砧木M26的離體葉片愈傷組織培養結果表明頂部1～4片葉的愈傷組織開始發生時間最早、愈傷組織產生量也最多；王艷等㈣的研究結果表明珠美海棠幼嫩葉片的再生效果明顯優于較老的葉片、中等大小的葉片再生效果優于大葉片和小葉片。李艷紅等對蘋果砧木M26研究表明，繼代后30d的試管苗葉片愈傷組織發生最早，25d和35d的次之，以后隨繼代天數增加愈傷組織發生推遲，繼代后25-35d，愈傷組織的發生量逐漸增加，以后隨繼代時間增加愈傷組織的發生量呈明顯下降趨勢。本文中，繼代培養30d的珠美海棠試管苗葉片的芽再生能力也明顯高于繼代培養60d，這與李艷紅等的研究結果基本一致。不同葉位、不同葉齡、不同大小及經歷不同繼代培養時間的葉片的內部生理狀態可能存在差異，可能正是這種內部生理狀態的差異導致了其分化能力的不同，對此也需做深入研究。

王艷等的研究表明，接種時切傷葉片可以明顯提高蘋果砧木羅6和珠美海棠葉片的再生率，許多研究中都描述了在進行蘋果葉片接種時均采取對葉片進行切傷，但切傷的方式存在差異，目前也未見不同切傷方式影響葉片再生效果的比較研究。Vieitez等㈣曾研究指出，清水鋼葉片培養中不定芽主要在葉柄殘余和主脈切口處的愈傷組織中形成。本文對4種葉片切傷方式的比較結果也顯示，主脈切口比其他部位的切口處芽的再生率明顯提高。分析其原因，可能是雙子葉植物葉片主脈含有維管束，在維管束的木質部和韌皮部之間還存在形成層，形成層細胞可能具有較強的分生能力和再生能力，因而促進了芽的再生。所以，橫切主脈的方式是珠美海棠葉片培養接種時較好的切傷方式。