資陽香橙×枳雜種苗鑒定及耐堿株系篩選

摘要：為培育耐堿的雜種砧木，以耐堿品種資陽香橙(Citrus junos Sieb.exTanaka)與不耐堿的枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]雜交，將雜種F-群體經形態學與SSR鑒定雜種真實性，并通過葉片黃化程度分級、葉綠素與有效鐵質量分數的測定以篩選耐堿雜種單株。結果表明，(1)與母本資陽香橙葉片形態上無明顯差異的F。都是珠心苗。(2)真實雜種苗從第10片葉開始都有三出復葉。(3)篩選到2對SSR引物能鑒定出全部雜種苗。(4)在堿性土上，耐堿雜種苗葉綠素cha+b的質量分數顯著低于耐堿親本資陽香橙，而極顯著高于不耐堿親本枳；但葉綠素a的質量分數顯著高于父母本。5、耐堿雜種葉片中有效鐵質量分數顯著高于枳。研究獲得了2株耐堿能力較強的真實雜種苗。

關鍵詞：柑橘；砧木；雜種鑒定；耐堿：SSR鑒定

中圖分類號：S666 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-20-06

砧木品種改良對支撐柑橘產業發展至關重要。近年國外育種者報道了一些柑橘砧木育種的研究，多采用了起源于中國的枳作為雜交親本。枳[Pon-cirus trifoliata (L.)Raf.]原產于我國，是我國廣泛使用的傳統砧木。但枳不抗裂皮病和碎葉病，對堿性土極為敏感，在堿性土上極易表現葉片缺鐵黃化癥狀，與柚類或低酸甜橙的某些品種嫁接不親和。資陽香橙(Citrus junos Sieb.ex Tanaka)是我國特有的、耐堿能力強的優良柑橘砧木品種。資陽香橙能適應pH值7.2-8.4的堿性紫色土，耐裂皮病和碎葉病，樹體壽命長。其主要不足之處在于：實生苗幼苗較易感炭疽病：以資陽香橙作砧木的柑橘樹，大小年與隔年結果現象更為明顯(數據未發表)。

為獲得綜合資陽香橙與枳的優點的新型砧木品種，有必要將2者進行雜交。由于雙親都是多胚品種，雜交F₁群體中含有較多的珠心苗。我們通過形態學與分子生物學相結合進行了雜種真實性鑒定，并對真實雜種苗進行了耐堿性初步篩選，以期獲得耐堿性較強的雜種苗。

1 材料和方法

1.1 材料

2008年以資陽香橙為母本，飛龍枳、普通枳、晚花枳為父本，進行雜交；2009年以資陽香橙和旺蒼大葉枳為親本進行正反交，獲得F₁代群體。以該F₁代群體作為供試材料。

1.2方法

1.2.1 F₁代群體的形態學鑒定父本與母本形態學有3點明顯差異，一是父本飛龍枳的枝條彎曲，枝刺呈倒鉤狀，與其他枳或柑橘類都不同。二是枳是冬季落葉的灌木或小喬木，而資陽香橙常綠。三是枳及其變種飛龍枳都是三葉，而資陽香橙為單葉。

參照加州大學早期研究結論：“枳的雜種苗在第2-8片葉都有三葉。在實生苗第8片葉展葉時，按時片形態學特征將全部實生苗分3種類型分開培育。

1型：第1-8片葉與母本都沒有形態差異；2型：第1-8片葉與母本顯然不同，但又沒有典型的父本三葉：3型：第1-8片葉出現與父本相似的三葉。

1.2.2 SSR分子標記鑒定

參照謝讓金等的改良CTAB法提取實生苗與父母本的DNA。按王福生等雷天剛等的方法設計SSR引物，PCR反應體系和反應程序見雷天剛等的方法。篩選了12對引物采用2對多態性高的SSR(Simple Sequence Repeat引物對實生苗進行雜種真實性鑒定。2對引物如下SSl7引物序列為：5’-TYCATTTGGAACAAAACC-CAATTC-3’，5’-GCTGCTAATCACAGCATCAAGAGA-3’；CSSR038引物序列為：5’-CTYGAAAATAAGTTGAGCCA-3’，5’-ATCCCCAAATGAATAATC-3’。

擴增產物用8％的非變性聚丙烯酰胺電泳檢測。

1.3 耐堿雜種苗的篩選

1.3.1 堿性土選擇與制備 2008年9月，從堿性紫色土果園取土，該園曾于1999年5月上旬按株行距10cm×25cm栽種14萬株枳3月齡實生苗，6月下旬至7月上旬，全部14萬株枳實生苗無一例外地出現葉片黃化癥狀，植株矮小、生長不良。2006年該園重新建園栽種枳砧和卡里佐枳橙砧柑橘樹，連年出現葉片嚴重缺鐵黃化癥狀。從該園挖取背景土置于室內陰干混勻，以莊伊美的方法測定pH=8.1。2008年12月20日將形態學鑒定的雜種實生苗與父、母本的小苗同時移栽到該堿性紫色土上，分株編號。2009年3月以后，記載各株系葉片缺鐵黃化癥狀。

1.3.2 植株葉片黃化程度分級 2009年8月10日，參照彭良志等的方法，略加改進，從1a生實生苗末次梢最上端1片充分老熟的葉片開始評級，以該葉往下數共5片葉片黃化程度作為分級依據，用目測法將全體雜種苗葉片黃化程度分為5級。

0級—完全沒有癥狀；1級一輕度缺鐵：主脈、側脈、網狀細脈及其附近葉肉都為綠色，少量葉脈間葉肉為淡綠色；2級一中度缺鐵：主脈、側脈綠色，部分網狀細脈與葉肉為黃綠色；3級一嚴重缺鐵：主脈與部分側脈為綠色，部分側脈黃綠色，網狀細脈與葉肉為黃白色；4級一極度缺鐵：僅有主脈為綠色，側脈與網狀細脈黃白色，全部葉肉白色。

植株葉片黃化程度按各取樣葉片的黃化程度分級求平均值4舍5人后定級。

1.3.3 葉綠素質量分數測定 在葉片黃化程度分組后，每株采5枚葉片，3-6次重復。以Wellberum等的方法用普析TU-1901型紫外可見分光光度計測定各級別雜種苗葉綠素質量分數。

1.3.4 葉片活性鐵質量分數測定 2010年7月中旬，從葉片不表現癥狀的2株耐堿雜種株系采樣，參照任麗軒等的方法測定葉片中活性鐵的質量分數。分別以相同pH值條件下的父母本和葉片黃化的雜種苗作為對照采樣分析。使用PE(AA-800型)原子吸收分光光度計測定。

1.4 數據分析

采用SPSS13.0軟件ANOVA方法作差異顯著性分析，LSD法作多重比較。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

2.1.1 父本枳的落葉與飛龍枳枝刺彎曲特征在F₁的遺傳所有資陽香橙與枳的雜種F₁冬季都不落葉，而對照父本自然授粉的實生苗冬季全落葉，母本自然授粉的實生苗常綠。

飛龍枳F₁所有實生苗都沒有遺傳枝或枝刺彎曲的特征。

2.1.2 三葉特征母本資陽香橙和父本枳的葉形變異如圖版-C-D，既不同于母本又不同于父本的葉形變異如圖版A。以資陽香橙為母本的真實雜種苗以第1片真葉為單葉，無翼葉，在第2-7片真葉開始表現出三葉特征，此后新長出的葉片以三葉為主，偶有單身復葉或二出復葉(圖版B)。資陽香橙×旺蒼大葉枳的一個株系在第10片葉表現出二出復葉特征，其后表現出三葉特征。資陽香橙為母本，枳為父本的F₁實生苗，形態學鑒定結果見表1。

反交實生苗幼苗的葉片形態與母本旺蒼大葉枳對比，初生葉都有單葉小葉片，出現三出復葉后，其形態與大小都看不出明顯差異。與父本對比，則差異都很明顯，看不出帶有父本資陽香橙的特征，在實生苗培育早期未見葉片形態的單葉與三葉或二葉相間著生的現象。

2.2 雜種苗SSR鑒定

2.2.1 資陽香橙♀×積♂的F₁代群體SSR鑒定以資陽香橙、旺蒼大葉枳、飛龍枳、普通枳和晚花枳為材料，從12對引物中篩選到2對多態性強的引物。利用這2對引物，對資陽香橙♀×枳♂所有F₁代形態學雜種苗進行鑒定，鑒定出的雜種結果見圖1。

用CSSR038與SSl7引物進行鑒定時，2對引物的鑒定結果一致，雜種苗均含有資陽香橙和枳的特征帶。其中CSSR038的特征帶在F₁出現性狀分離。

對部分葉片形態與母本相似的F₁代進行了鑒定，但與母本相比譜帶無差異。2對引物均沒有父本特征帶的實生苗通過形態學比對，都無三葉，均淘汰不進行評價。

2.2.2 旺蒼大葉枳♀×資陽香橙♂的F₁代群體的分子生物學鑒定

由于枳的三葉為顯性性狀，因而，旺蒼大葉枳♀×資陽香橙6的F₁代群體的葉片都具有三葉的特性，在冬季落葉以前不易從形態學上有效的區分雜種苗和珠心苗。利用SSl7引物，對旺蒼大葉枳×資陽香橙雜交所獲得的所有F₁代群體進行了SSR鑒定，從F₁代群體中獲得了13株雜種苗。

SSR鑒定表明：4個以資陽香橙為母本的雜交組合，所有雜種苗都有枳的三葉特征。而沒有三葉的實生苗，盡管出現過完全不同于母本的葉形變異特征(圖2)，但都不是真實雜種苗。因此，培育1a后，F₁葉形與母本葉形沒有差異的實生苗都是資陽香橙的珠心苗，可以提前淘汰。

形態學上難以區分的2株資陽香橙♀×普通枳♂F₁實生苗：第518號株系在第22片葉片才表現出二出復葉特征，但其后，該實生苗和該株系的高接樹1a后，都無二出或三出復葉；第51號株系，除二出復葉與三葉外，在第6、第8葉還表現出五出羽狀復葉特征，這種羽狀復葉與卡里佐枳橙的個別株系相同。經這2對SSR引物鑒定結果：518號株系的譜帶與母本資陽香橙完全相同，是珠心苗；51號株系為真實雜種苗。反交也有2個株系出現五出復葉，經SSR鑒定同樣是真實雜種苗。

2.3 耐堿雜種苗初步篩選

2.3.1 葉綠素質量分數測定

在pH8.1的堿性土條件下，移栽8個月后，枳已表現出嚴重缺鐵黃化癥狀，而資陽香橙嫩梢葉片略有黃化，香橙與枳的雜種F₁表現不同程度的耐堿性。按葉片黃化程度篩選，2株真實雜種苗缺鐵黃化程度為0級，即完全不表現缺鐵黃化癥狀；其他雜種苗葉片黃化級別為：1級14株，2級23株，3級23株，4級55株。雜交親本及各級別雜種苗葉片葉綠素質量分數見圖3。

4級—極度缺鐵的雜種苗與對照枳黃化程度無差異，而O級一不表現缺鐵癥狀的雜種苗葉片顏色青綠色，與資陽香橙相當。葉綠素測定結果經SPSSl3.0軟件(P<0.05)分析表明：4級一極度缺鐵的雜種苗與對照枳的葉綠素(cha、chb或者cha+b)質量分數均無差異，所有雜種苗葉綠素總量(cha+b)和葉綠素b(chb)質量分數顯著低于資陽香橙。而0級一完全不表現缺鐵癥狀的雜種苗葉綠素a的質量分數都顯著高于1級一缺鐵癥狀極輕的雜種苗，2者又都高于耐堿親本資陽香橙，黃化程度2-4級的材料與父本枳的葉綠素cha質量分數都顯著低于母本。因此，初步篩選到2株耐堿能力較強的株系。在后續培養中，將已表現缺鐵癥狀株系淘汰。

2.3.2 葉片活性鐵質量分數測定 繼續在田間露地栽培管理1 a后，父母本、耐堿株系、葉片繼續黃化株系的活性鐵質量分數見表2。

經SPSSl3.0軟件分析，耐堿性較強的株系的葉片活性鐵質量分數顯著低于母本資陽香橙，但顯著高于枳和黃化的雜種苗。

3 討論

三葉遺傳，學術上有2種理論，有研究結果表明：“枳可能具有同質結合的2個顯性基因(domi-nant gene)，當雜種一代中只要具備一個顯性基因便出現三葉。但又有學者研究柚×馬蜂柑的F₁群體中發現，約1／3的雜種是三葉，據此他認為三葉可能由2個互補的顯性基因所決定。本試驗形態學結合SSR鑒定的真實雜種苗都有三葉，沒有出現三葉與單身復葉的性狀分離，說明本試驗的4個單系枳都是由2個顯性基因同質結合的，而非由2個互補的顯性基因所決定。因此今后形態學就可判別：沒有三出復葉的F₁實生苗都不是枳的真實雜種苗。

自然授粉的飛龍枳實生苗對照樹，枝與枝刺的彎曲性狀出現了性狀分離，有的實生苗完全不發生枝或枝刺的彎曲。本試驗中飛龍枳為父本的雜種F₁沒有出現彎曲的枝或枝刺，說明飛龍枳的彎曲枝或枝刺可能為同質結合的隱性基因決定的，這一性狀無助于以其為父本的雜種真實性鑒定，但如果以其為母本，或將有益于鑒定珠心苗。

枳是落葉果樹，在重慶北碚生態條件下。1a生露地實生苗冬季都要完全落葉，但是枳與柑橘類的雜種如卡里佐枳橙或斯文格枳柚1a生實生苗在冬季常綠，這一特征能在田間將這2個枳的雜種與枳區分開來。本試驗以枳為父本的雜種苗冬季都常綠，沒有落葉。

SSR技術正廣泛應用于指紋圖譜構建和對柑橘種質遺傳多樣性及親緣關系的研究，本試驗利用SSR引物可以將所有真實雜種苗鑒定出來。與形態學鑒定相比較，在雜種F₁群體較小時，SSR有利于提早鑒定。但在群體數以千計時，對父母本形態學差異特別明顯的雜交組合，形態學鑒定有時可能更直觀，更簡單高效。2種方法相結合，就可事半功倍，這對于加速砧木育種的抗性評價進程將非常有益。

本試驗嘗試用堿性石灰質土壤直接栽植雜種苗來鑒定雜種的耐堿性。在石灰質堿性土壤中，鐵易形成不溶性的化合物而使植株缺鐵，鐵是合成葉綠素必需的元素，缺鐵最明顯的癥狀就是新梢葉片失綠黃化。有學者研究認為，缺鐵失綠樹地上部的鐵質量分數降低，但也有研究表明黃化葉片中鐵元素質量分數不變或反而升高。本試驗以原子吸收法測定了葉片中鐵元素的質量分數，結果總鐵質量分數沒有顯著性差異，這說明葉片營養診斷不一定能真實反映葉片缺鐵與否。因此，葉綠素質量分數的測定和鮮葉中活性鐵質量分數的測定更能說明問題。由于cha與葉片光合效能有關，這可能解釋了耐堿的雜種株系生長量顯著大于父母本的現象。耐堿的株系的cha+b和活性鐵質量分數均低于耐堿親本資陽香橙，但顯著高于不耐堿親本枳。

由于枳和枳雜種的“童期”通常要數年之久，初步篩選到的耐堿株系繼續鑒定1a后，仍未出現葉片黃化癥狀，但仍有必要等到這些株系開花結實后取種子繁殖F₁實生苗進一步鑒定篩選，以進一步了解不同株系耐堿的pH極限范圍。