蘋果內根-貝殼杉烯氧化酶基因的克隆及序列分析

摘要：內根-貝殼杉烯氧化酶(KO)是赤霉素合成代謝的關鍵酶。以蘋果(MolusxdomesticaBorkh.)品種富士(Fuji)為供試材料，應用同源克隆和RACE方法從其莖尖中克隆到KO的eDNA全長序列，命名為MdKO，GenBank登錄號：AY563549，其長度為1859bp。MdKO的開放性閱讀框(ORF)編碼514個氨基酸殘基，推斷其相對分子量為58.9 ku，等電點為7.63。氨基酸同源性分析表明，MdKO與已報道的其他植物的KO氨基酸序列具有較高的相似性；氨基酸聚類分析表明，蘋果和梨首先聚類，其次是葡萄；序列結構分析表明MdKO屬于細胞色素超家族P450系，具有細胞色素P450的血紅素結構域FXXGXRxCXG和跨膜結構域；亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)MdKO可能位于內質網(wǎng)膜上。

關鍵詞：蘋果；內根-貝殼杉烯氧化酶；赤霉素；序列分析

中圖分類號：$661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)-01-01-07

赤霉素(gibberellins，GAs)是一類廣泛存在于高等植物體內的四環(huán)二萜羧酸，它作用于高等植物的整個生命過程，影響種子的萌發(fā)、莖的伸長、開花的誘導及果實的生長等。其中，對植株高矮的控制，是赤霉素最令人矚目的生理作用之一。

GAs生物合成過程中的關鍵酶主要有柯巴焦磷酸合成酶(CPS)、內根-貝殼杉烯合成酶(KS)、內根-貝殼杉烯氧化酶(KO)、內根-貝殼杉烯酸氧化酶(KA0)、GA-20氧化酶、GA3p-羥基化酶等。其中KO是位于內質網(wǎng)且與膜結合的依賴細胞色素P450和NADPH的單加氧酶，其通過一系列羥基化作用，將內根-貝殼杉烯的C-19甲基氧化，分別形成內根-貝殼杉烯醇、內根-貝殼杉烯醛和內根-貝殼杉烯酸。擬南芥的GA3和豌豆的LH分別編碼KO。擬南芥的gu3突變體是因KO的功能欠缺，導致植株矮化。豌豆的lh突變體是因內根-貝殼杉烯氧化被阻斷最終導致植株矮化。自然突變獲得的半矮化水稻Tan-GinbOZll(d35Tan-ginbozu)是GAs缺陷型突變體，其GAs合成過程中，由于KO催化的步驟受阻，從而影響了GAs的合成，結果導致植株矮化目。

目前，編碼KO的基因在擬南芥、豌豆、水稻、南瓜、玉米等草本植物上相繼得到克隆，但在多年生果樹上的研究較少，只報道了葡萄(xP_002282197)、咖啡(ACQ99375)、梨、草莓和桃的cDNA片段。Korban等曾在蘋果的砧木中克隆到類似擬南芥的GA3的2個cDNA片段(G0501785和DT041574)，并且未見后續(xù)研究報道。

果樹的矮化性狀是一個非常重要的農藝性狀，在提高產(chǎn)量、改進品質和變革果樹種植模式上發(fā)揮著巨大作用。但由于對其矮化機制缺乏深入研究，限制了矮化育種的進展。我們將以蘋果莖尖為試材，克隆蘋果的KO全長基因(MdKO)，并對獲得的基因進行生物信息學分析，以期探討赤霉素在合成的上游部分調控蘋果生長發(fā)育的機制。該研究不僅可為將來探索果樹的矮化機理提供依據(jù)，同時對利用基因調控技術改良果樹樹型有重要意義。

1 材料和方法

1.1植物材料

2009年4月中旬在青島農業(yè)大學萊陽果樹試驗站采集蘋果(Malusxdomestiea Borkh，)品種富士(Fuji)旺盛生長的莖尖組織約1g，置于盛有液氮的冰壺帶回室內，投入超低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1 總RNA的提取RNA提取參考Kseniia等㈣的方法。將RNA溶于50μL的DEPC-H₂O中。取少量用于RNA質量和濃度的檢測，其余置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MdKO的中間序列獲得依據(jù)GenBank查詢結果，通過對桃(Prunus penica)、草莓(Fragariagrandiflora)、南瓜(Cucurbita maxima)、豌豆(Pisumsativum)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的KO氨基酸序列比對，獲得該基因的保守域，并根據(jù)保守域設計上游兼并引物F1、F2和下游兼并引物R(表1)。反轉錄反應和PCR擴增參照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒說明書進行。用F1／R進行第1次PCR擴增，將擴增產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，以F2／R進行第2次PCR擴增。經(jīng)過巢式PCR擴增后。將擴增片段回收純化，連接于pGEM-T Easy(Promega)載體，并轉化到E.eoli DH5細胞，克隆測序后獲得MdKO的中間序列。

1.2.3 MdKO的3’-RACE和5’-RACE 3’-RACE和5’-RACE反應使用SMART RACE eDNA Am-plifieation Kit試劑盒。首先根據(jù)試劑盒說明書合成-3’RACE-Ready eDNA和5’-RACE-Ready eDNA。根據(jù)MdKO的中間序列設計特異引物，3’-RACE引物：GSPl和GSP2；5’-RACE引物：GSP3和GSP4(表1)。以GSPl／UPM和GSP3／UPM進行3’-RACE和5'-RACE的第1次PCR擴增；用第1次PCR擴增產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，以GSP2／NUP和GSP4／NUP進行巢式PCR擴增。反應體系和程序參照試劑盒使用說明。將目標產(chǎn)物經(jīng)過回收克隆后進行測序。

1.2.4 MdKO的基因全長獲得將獲得的中間序列3’-RACE和5’-RACE的序列，利用DNAMAN拼接獲得MdKO的全長序列，利用ORFFinder軟件獲得其開放性閱讀框。根據(jù)開放性閱讀框設計特異引物MdKOF和MdKOR(表1)，擴增得到MdKO的ORF。

1.2.5 生物信息學分析MdKO編碼的氨基酸的理化性質采用ExPASy的Protparam軟件進行預測；使用DNAMAN6.0軟件進行同源比對及繪制系統(tǒng)進化樹；利用NCBI中的BLASTP進行蛋白質保守結構域分析；采用ExPASy的Prosite軟件進行蛋白質功能位點預測；用TMHMM Server v.2.0進行跨膜區(qū)分析：利用在線軟件PSORT進行亞細胞定位；運用PBIL LYON-GERLAND對MdKO進行二級結構預測：蛋白質的立體結構預測和觀看采用SWISS-MODEL和Raswin軟件。

2 結果與分析

2.1 MdKO全長cDNA序列的獲得

用蘋果莖尖總RNA的反轉錄產(chǎn)物為模板，以F1／R，F(xiàn)2／R為引物，經(jīng)過巢式PCR，得到長度為717

2.2 MdKO cDNA的序列分析

2.2.1 MdKO推導的氨基酸序列的同源性分析氨基酸序列同源性比對結果表明，KO的C端序列相對保守，但N端序列保守性相對較差(圖3)。聚類分析表明，MdKO和梨的氨基酸序列屬于同一個進化支，與葡萄屬于同一分支(圖4)。氨基酸同源矩陣表明，蘋果與梨、葡萄、咖啡、南瓜、擬南芥、豌豆、草莓的氨基酸序列的同源性超過60.0％，其中與梨的同源性最高，達95.4％。

2.2.2 MdKO的結構分析利用GenBank中BLASTP對MdKO進行蛋白質保守結構域分析，結果表明蘋果MdKO屬于細胞色素超家族P450系(圖5)。細胞色素P450單加氧酶是一類位于膜上的血紅素蛋白，是高等植物中最大的酶蛋白家族，在植物體內擔當重要的功能。研究表明，細胞色素P450具有2個顯著的結構域：羧基端的血紅素結構域和氨基端的跨膜結構域。血紅素結構域在所有的P450中完全保守，序列為：FXXGXRXCXG，其中的半胱氨酸(C)是亞鐵血紅素的第5個軸配體。bp的中間片段(圖1-A)；以GSPl／UPM，GSP2／NUP為引物，經(jīng)過巢式PCR，得到產(chǎn)物長度為598 bp的3’端(圖1-B)；以GSP3／UPM，GSP4／NUP為引物，經(jīng)過巢式PCR，得到產(chǎn)物長度為480 bp的5’端(圖1-C)。將獲得的蘋果莖尖MdKO的三部分eDNA片段利用DNAMAN 6.0拼接后，得到全長為1859 bp的cDNA序列(GenBank登錄號：AY563549)。利用ORF Finder軟件獲得其開放性閱讀框，根據(jù)ORF設計特異引物，獲得MdKO基因全長(圖I-D)，該閱讀框長度為1542 bp，編碼514個氨基酸殘基(圖2)，其蛋白質分子量為58.9 ku，等電點為7.63。

利用http：//us.expasy.ch/prosite在線分析，在所得到的MdKO的氨基酸序列中，距離羧基端52-61位氨基酸為該保守區(qū)域，其序列為：FGAGKRVCAG，因此該區(qū)域是蘋果MdKO的半胱氨酸(C)亞鐵血紅素結合位點(圖2、6)。

此外，多數(shù)植物P450是內質網(wǎng)結合蛋白，氨基端有一疏水性螺旋將其錨定在內質網(wǎng)膜上并將其余大部分蛋白定位于內質網(wǎng)膜外胞質面。緊臨氨基端疏水螺旋的為一富含脯氨酸(P)的保守區(qū)，含有保守的(P/I)PGPX(G/P)XP序列。

利用在線軟件TMHMM Server v.2.0對MdKO進行跨膜區(qū)分析。結果表明，距離氨基端1-15位氨基酸位于膜內，16-38位的氨基酸位于跨膜螺旋區(qū)，39-514位的氨基酸位于膜外(圖7)，這與在擬南芥、南瓜、草莓上的研究相符合。通過在線軟件PSORT(http：//psort.ims.u-tokyo.ae.jp/form.html)進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)MdKO位于內質網(wǎng)膜上，這進一步證明本實驗所克隆的基因的正確性。但值得注意的是氨基端富含脯氨酸區(qū)域的序列并不完全符合以往發(fā)表的P450酶結構模式(P/I)PGPX(G/P)XP，在MdKO中是PSVPVVPGWP(圖2)。

用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(HNN)分析MdKO的氨基酸序列，結果表明，MdKO的二級結構是由大量的α一螺旋、無規(guī)則卷曲和少量的擴展鏈結構組成，其中α-螺旋結構有258個，占50.19％，而擴展鏈和無規(guī)則卷曲分別占10.7％和39.11％。同源建模是一種從蛋白質的氨基酸序列出發(fā)，建立3D模型的計算方法。建立一個成功的模型需要至少一個已經(jīng)通過實驗測定的蛋白質3D結構，并且該蛋白質的氨基酸序列應與目標序列有顯著的相似性。本研究利用SWISS-MODEL軟件，以人的微粒體P450的晶體結構為模板，對MdKO的三維結構進行預測，結果如圖8。

3 討論

20世紀50年代的“綠色革命”中，水稻因GA20-氧化酶功能的缺陷產(chǎn)生半矮稈植株，提高了水稻的抗倒伏能力且顯著提高了水稻的產(chǎn)量，由此引發(fā)了人們對植株高度和赤霉素生物合成酶類的廣泛關注。KO在GAs合成途徑中催化三步反應，在植物矮化型、徒長型突變體內表達豐度差別很大，是目前研究相對較多的GAs生物合成限速酶。Faust研究認為果樹樹型機制是以赤霉素為中心的激素代謝不平衡造成的。朱海濤等也認為GAs是控制樹體大小的最重要的激素。因此，研究GAs合成的相關基因KO可能對從分子水平探明果樹樹型機制具有重要意義，并可為優(yōu)良種質的創(chuàng)新提供重要依據(jù)，從而更好地服務于果樹育種和生產(chǎn)。

研究克隆到MdKO的全長序列，與Korban等在蘋果的砧木中克隆到類似擬南芥的GA3的2個eDNA片段同源性較高，但并不完全一致，這可能是物種間差異造成的。本試驗獲得的MdKO與梨首先聚類，其次是葡萄、草莓。梨的PpKO與蘋果先聚類，其次是草莓、葡萄，這可能是蘋果和梨同屬于薔薇科(Rosaceae)，在植物分類上親緣關系較近的緣故，同時也說明KO在親緣關系較近的物種中保守性較強。

研究克隆到蘋果KO基因的全長序列，并利用生物信息學對該基因的功能域和結構進行了分析和預測，為在分子水平上利用反義技術、基因敲除、定向突變等手段研究KO的作用與功能提供了依據(jù)。同時為展開關于該基因的表達研究，并進一步確定其功能奠定了基礎。