中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導及植株再生

摘要：以中國李Nubiana試管苗幼嫩葉片為外植體，探討激素濃度配比、暗培養(yǎng)時間、瓊脂濃度等對胚性愈傷組織誘導及TDZ濃度對胚性愈傷組織不定芽再生的影響，建立其愈傷組織誘導及不定芽再生體系。結(jié)果表明，外源激素對中國李Nublana胚性愈傷組織誘導影響顯著，TDZ不適合胚性愈傷組織的誘導；暗培養(yǎng)28 d，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地較好，誘導愈傷組織的效果最佳。胚性愈傷組織在WPM+NAA0.5mg·L^-1+6-BA2.0mg·L^-1TDZ2.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6.0g·L^-1培養(yǎng)基上光培養(yǎng)可再生出不定芽，其再生率為6.7％。

關(guān)鍵詞：中國李Nubiana；葉片；胚性愈傷組織；植株再生

中圖分類號：$662.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-42-04

李(prunus)，薔薇科，李屬，多年生落葉核果類果樹，它具有較強的適應(yīng)性，在我國大部分地區(qū)均有種植。李具有多種優(yōu)良的抗寒、抗旱野生基因型，可為我國將來李雜交育種和基因工程育種提供豐富的基因種類Ⅲ。但在李上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)還存在許多問題，其中最關(guān)鍵的問題是李的高頻再生體系尚未完全建立。目前國內(nèi)外在李的再生體系中，通過雜合體子葉、下胚軸獲得再生植株的報道相對較多，而在營養(yǎng)體葉片、根等方面報道較少，且尚未見由胚性愈傷組織再生植株的報道。胚性愈傷組織再生不但可以擴大不定芽繁殖系數(shù)，也為將來制造人工種子，導人外源基因和種質(zhì)資源保存奠定基礎(chǔ)。樊青峰等以中國李Nubiana葉片為試材，對其愈傷組織的誘導、繼代培養(yǎng)及褐變調(diào)控進行了研究，誘導出愈傷組織，但愈傷組織未能分化形成不定芽。因此，我們以中國李Nubiana試管苗幼嫩葉片為試材，進一步研究了激素濃度配比、暗培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中瓊脂濃度等對胚性愈傷組織誘導的影響，以及TDZ濃度對胚性愈傷組織不定芽再生的影響，以期建立穩(wěn)定高效的胚性愈傷組織誘導及再生體系。

1 材料和方法

1.1 材料

材料為中國李Nubiana(Prunus salicina)試管苗，30d繼代1次；繼代培養(yǎng)基：LP+IBA0.06 mg·L^-1+6-BA0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂7.0g·L^-1，pH值為5.90-6.00。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 1)中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導。(1)激素配比：細胞分裂素用TDZ，6-BA，生長素用2，4-D，IBA，從不同濃度范圍進行組合；(2)暗培養(yǎng)時間：設(shè)計不同暗培養(yǎng)時間0、7、14、21、28、35、42、49 d；(3)瓊脂濃度：設(shè)計4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g·L^-1，等幾種瓊脂濃度。

2)中國李‘Nubiana’胚性愈傷組織再生。TDZ濃度：分別添加0、2.0、4.0、6.0mg·L^-1等不同濃度TDZ。

3)中國李Nubiana胚性愈傷組織保存。中國李Nubiana胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：LP+2，4-D1.0mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+蔗糖40g·L^-1+瓊脂6.0g·L^-1，pH值為5.90-6.00。

1.2.2 試驗方法 繼代培養(yǎng)3周左右生長健壯的無菌試管苗，取上部較嫩的2-5片葉，接種在各誘導培養(yǎng)基上；誘導培養(yǎng)基除特殊說明外一般用WPM+2，4-D2.0 mg·L^-1+6-BA1.0 mg·L^-1+葡萄糖30g·L^-1+瓊脂5.0g·L^-1。

取繼代培養(yǎng)3周左右，長勢較好的胚性愈傷組織。接種在各再生培養(yǎng)基上；再生培養(yǎng)基除特殊說明外一般用WPM+NAA0.5mg·L^-1+6-BA2.0mg·L^-1+TDZ2.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6.0g·L^-1，pH值為5.90-6.00，除TDZ為過濾滅菌之后加入外，其他成分均在高壓滅菌前加入。

試驗培養(yǎng)條件為培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，光照強度2000-3000lx，光照周期16h光照／8h黑暗。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗處理接種30個外植體，重復3次；葉片接種于誘導培養(yǎng)基后對葉片愈傷組織的誘導和愈傷組織植株再生過程進行觀察，并在28d對出愈率、出愈量及植株再生率進行統(tǒng)計(暗處理除外)。試驗數(shù)據(jù)用SAS軟件(8.1版本)的ANOVA過程進行差異顯著性分析。其中出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)／外植體數(shù)×100％；出愈量：愈傷組織發(fā)生量；再生率=再生愈傷數(shù)／接種愈傷數(shù)×100％。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導

2.1.1 胚性愈傷組織生長狀況 葉片接種在培養(yǎng)基上7d左右，切口處略微膨大，葉邊緣向遠軸面卷曲翹起；接種14d左右，葉片切口處膨大，有微量愈傷產(chǎn)生，愈傷組織呈淡黃色；接種21d左右，葉片切口處產(chǎn)生的愈傷繼續(xù)膨大，愈傷組織為淡黃色、顆粒狀；接種28d左右，愈傷組織在切口處大量生長，呈現(xiàn)淡黃色、顆粒狀；接種35d左右，愈傷組織出現(xiàn)老化現(xiàn)象，顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變成黃色(圖A-F)。

2.1.2 激素濃度配比對中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導的影響 由表1可知，處理16和18愈傷組織出愈率最高，且出愈量較大。但處理18誘導出的愈傷組織，在之后繼代保存及再生過程中，呈水漬狀，極容易褐變，因而TDZ不適合中國李Nubiana愈傷組織的誘導。分別比較IBA+6-BA和2，4-D+6-BA的組合，當6-BA濃度相同時，IBA誘導的葉片出愈率和出愈量都比2，4-D誘導的葉片少，表明2，4-D的愈傷誘導效果優(yōu)于IBA的誘導效果。綜合上述結(jié)果，2，4-D+6-BA的組合較適合中國李Nu-biana愈傷組織的誘導。從32個處理中可以看出，處理16即當2，4-D為2.0mg·L^-1，6-BA為1.0mg·L^-1時，葉片出愈率較高，為97.8％，且出愈量較大；同時在之后的繼代保存過程中，能較好的保持胚性愈傷組織原有狀態(tài)并能再生不定芽。因而2，4-D2.0mg·L^-1與6-BA1.0mg·L^-1為中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導的最適宜激素濃度。

2.1.3 暗培養(yǎng)時間對中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導的影響 暗培養(yǎng)時間對中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導有較大影響。從愈傷組織出愈率來看，未進行暗培養(yǎng)或暗培養(yǎng)時間過短都不會產(chǎn)生愈傷組織，暗培養(yǎng)14d葉片出愈率可達到100％，但出愈量較低；隨著暗培養(yǎng)時間的增長，出愈量有所增加，暗培養(yǎng)28d可即可產(chǎn)生大量愈傷；愈傷組織的顏色和形態(tài)隨著暗培養(yǎng)時間的增長有顯著變化，暗培養(yǎng)28d可產(chǎn)生淡黃色、顆粒狀、較疏松的愈傷組織，有利于其繼代保存及植株再生，但如暗培養(yǎng)時間繼續(xù)增長，愈傷組織顏色加深，有褐變的趨勢不利于其保存及再生(表2)。

2.1.4 瓊脂濃度對中國李Nubiana葉片愈傷組織誘導的影響 瓊脂濃度雖然對愈傷組織出愈率和出愈量影響不大，但直接影響愈傷組織發(fā)生時間及其狀態(tài)。由表3可知，當瓊脂濃度為5.0g·L^-1時，出愈率最高。為100％，出愈量較大，且愈傷發(fā)生時間較早，10d左右就能看到葉片切口處愈傷組織發(fā)生；當瓊脂濃度為6.0g·L^-1時，雖然愈傷誘導率較高，出愈量較大，但愈傷形成的時間較瓊脂濃度為5.0g·L^-1時晚1-2d：當瓊脂濃度繼續(xù)增大時，出愈率下降，出愈量減少，愈傷組織發(fā)生時間也推遲；而當瓊脂濃度為4.0g·L^-1時，雖然出愈率較高，出愈量較大，但所形成的愈傷組織為水漬狀，難以再生。

2.2

TDZ濃度對中國李Nubiana胚性愈傷組織植株再生的影響

TDZ對木本植物的離體芽增殖具有顯著的促進作用。當所添加的TDZ濃度為2mg·L^-1時，愈傷組織再生出不定芽，再生率為6.7％(圖G-1)。但隨著TDZ濃度的增加，中國李Nubiana胚性愈傷組織未出現(xiàn)植株再生現(xiàn)象(表4)。

3 討論

3.1 激素濃度配比對中國李Nubiana葉片愈傷組織誘導的影響

激素對組織離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及其調(diào)控起著十分關(guān)鍵的作用。研究結(jié)果表明，單獨使用2，4-D可誘導出愈傷組織，但出愈率較低，出愈量較少，且得到的愈傷組織極疏松，不適宜后期愈傷組織植株再生：單獨使用6-BA對中國李愈傷組織的誘導效果極差，愈傷組織生長速度慢，老化時間早。2，4-D和6-BA配合使用，可以提高出愈率和出愈量，同時愈傷組織為淡黃色、顆粒狀、較疏松。而使用2，4-D和TDZ對愈傷組織進行誘導時，雖然出愈率和出愈量較高，但愈傷組織疏松、呈一定的水漬狀，這可能與TDZ高活性有關(guān)。

3.2 暗培養(yǎng)時間對中國李Nubiana葉片愈傷組織誘導的影響

暗培養(yǎng)對胚性愈傷組織的生長發(fā)育、形態(tài)構(gòu)成有一定的調(diào)控作用。師校欣等研究發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)的天數(shù)越多，愈傷組織的發(fā)生量越大，與暗培養(yǎng)0周的對照相比，暗培養(yǎng)4周的愈傷組織要大1-2倍。研究結(jié)果表明，中國李葉片不經(jīng)過暗培養(yǎng)不能產(chǎn)生胚性愈傷組織。隨著暗培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織生長量逐漸增加，但暗培養(yǎng)時間過長，誘導出的愈傷組織容易發(fā)生褐變現(xiàn)象。

3，3 中國李Nubiana胚性愈傷組織植株再生

Canli等單獨使用TDZ誘導日本李子葉，獲得了再生芽。同時指出TDZ誘導不定芽的效果優(yōu)于6-BA。本研究表明，在添加TDZ2.0mg·L^-1的胚性愈傷組織再生培養(yǎng)基上，誘導出6.7％的不定芽，說明TDZ對分化不定芽有促進作用。

愈傷組織變綠是胚性愈傷組織植株再生的前提，但將愈傷組織光下培養(yǎng)后，褐變程度升高，不利胚性愈傷組織進一步分化。愈傷組織褐變主要與愈傷組織中的次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。次生產(chǎn)物中酚類物質(zhì)在接觸空氣中的氧氣時，會自動氧化或由于機械損傷使酚氧化酶和底物接觸，從而使酚類物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì)。研究認為光是多酚氧化酶促因子，增加光照可以提高多酚氧化酶活性，從而導致愈傷組織褐變加劇。解決胚性愈傷組織褐變，是提高中國李Nubiana胚性愈傷組織植株再生率的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為WPM+2，4-D2.0 mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+葡萄糖30g·L^-1+瓊脂5g·L^-1；暗培養(yǎng)28d誘導出的愈傷組織最佳。利用中國李Nubiana胚性愈傷組織誘導出了不定芽，并可重復誘導。基本建立了通過誘導中國李Nubiana胚性愈傷組織再生不定芽的再生體系。