石榴種質資源遺傳多樣性及親緣關系的ISSR分析

摘要：利用ISSR標記技術對47個石榴品種遺傳關系進行了分析。篩選出多態性高的6條ISSR引物，共擴增出120條DNA條帶，其中多態性帶109條，多態性百分率為90，83％，有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣(H)、Shan-non信息指數(I)分別為1.2945±0.3094、0.1897±0.1618、0.3091±0.2198，遺傳距離(Dg)變異為0.0750～0.4000，表明石榴品種間存在比較豐富的遺傳多樣性。利用UPGMA法構建分子樹狀圖，將47個石榴品種分為5個類群。同時檢測到15條特異性條帶，可用于供試石榴中的11個品種鑒定的參考性標記。

關鍵詞：石榴；ISSR；種質資源；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號：$665.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-66-06

石榴(Puntca granaturn L.)為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，又名若榴、丹若、天漿、金罌、狂花等。石榴原產伊朗、阿富汗等中亞一帶，從西漢張騫出使西域將涂林安石榴引入我國，至今已有超過2000a的栽培歷史，經長期天然雜交及基因突變。以及采用實生、分株、嫁接等多種繁殖方法，使其產生了復雜多樣的品種和類型，據不完全統計，我國現有石榴品種資源約200多個，分布南北各地20多個省區。各地研究者對石榴種質資源進行調查研究時，大多都局限于某一地區，各自從不同的角度對石榴進行了種下分類，導致品種混雜、同種異名、同名異種的現象出現，長期以來，給準確進行品種資源鑒定和利用帶來了困難。我們究旨在利用ISSR標記技術，對石榴的遺傳多樣性與親緣關系進行分析，以期為石榴種下分類提供分子依據，為更有效地保護石榴資源及選育新品種提供遺傳信息。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的47個石榴品種資源(表1)采自云南蒙自縣石榴研究所石榴品種資源圃、四川會理縣農業局石榴品種資源圃及新疆、河南零星采集，采集后用冰壺運回，于-70℃冰箱保存。

1.2 DNA提取

采用改良CTAB法從石榴幼葉中提取總DNA，具體操作參見趙麗華等的方法，并稍加改進：CTAB裂解液加入0.015mol·L^-1硼酸，65℃水浴延長至1h。0.8％(w／v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，并用biospee-mini DNA／RNA／protein核酸蛋白分析儀測定DNA含量，放人-20℃冰箱保存。工作液稀釋到50mg·L^-1，放入4℃冰箱里備用。

1.3 引物篩選及PCR擴增

由上海英駿生物技術有限公司根據加拿大哥倫比亞大學(Univer sity of British Columbia，UBC)公布的第9套引物序列合成100條ISSR引物，篩選出DNA條帶清晰、多態性較高的引物，用MastercyclerGradient PCR儀(Eppendoff)篩選出引物的最適退火溫度，對47個石榴品種基因組DNA進行ISSR-PCR擴增，最后進行數據統計分析。優化確定25μL的PCR反應體系含有的組分和終濃度為：Mg²⁺1.75mm01.L^-1、dNTPs 0.15 mmol·L^-1、Taq DNA聚合酶1U、模板DNA 40ng、引物0.6 mmol·L^-1及1×PCRbuffer。擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性45s，退火(溫度表2)1min，72℃延伸2min，40個循環：72℃延伸10min。立刻進行電泳。

1.4 擴增產物檢測及數據統計分析

ISSR-PCR產物采用2％瓊脂糖凝膠(含100IxL.L^-1 Goldview核酸染料)分離擴增產物，電壓為2V.cm^-1，電泳2h，用復日FR-200A全自動紫外與可見分析裝置觀察并拍照記錄。

將保存的電泳圖譜采用Cross Checker-2.91版軟件結合人工計數對各引物擴增圖像進行條帶統計，每一條帶(DNA片段)為一個分子標記，代表引物的一個結合位點，根據各DNA片段的遷移率及其有無進行統計，對清晰的帶(包括強帶和清晰可辨的弱帶)，在相同遷移位置上有帶記錄為1，無帶記錄為0，統計各引物的多態性位點，建立由“0、1”組成的二元數據矩陣數據庫。采用PopGen32軟件在假定Hardy-Weinberg Disequilibrurr條件下，計算等位基因數(Na:Observed number of alleles)、有效等位基因數(Ne:Effective number ofalleles(Kimura andCrow(1964)、Nei’s基因多樣性(H：Nei’s(1973)gene diversity)、Shannon信息指數(I:Shannon’s In-fomlation index(Lewontin(1972)、多態位點百分率(P:The percentage 0f polymorphic loci)，利用NTSYSpc-2.10版軟件計算47個石榴品種間遺傳距離(Dg.genetic distance)或遺傳相似系數(sg.geneticsimilarity，sg值為1-Dg)，然后基于非加權配對算術平均法(UPGMA)構建親緣關系聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測結果

由瓊脂糖凝膠電泳圖(圖1)可以看出，點樣孔干凈，DNA主帶清晰，無拖尾現象，核酸蛋白儀對所提DNA檢測結果顯示D_260nm/D_280nm值在1.772～1.837，D_260nm/D_230nm比值大于2.0，提取的石榴DNA產量在137.12-218.33μg·g^-1，結果表明，所提石榴基因組DNA為高質量、高產率的DNA。

2.2 ISSR擴增結果

篩選出的6條ISSR引物(表2)在47個石榴品種中共擴增出120條DNA條帶，平均每條引物擴增出20條DNA條帶，其中109條顯示多態性，平均每個引物擴增出18.2條多態性條帶，多態性條帶比率(PPB)為90.83％，通過與Marker的比較分析，石榴ISSR擴增片段大小約在200～2800bp(引物UBC900擴增結果圖2)。6個ISSR引物擴增的DNA條帶數(表2)在11-24條，多態性百分率在85.71％～100％：其中引物UBC846擴增出的DNA條帶數為11，譜帶數最少，但多態性條帶比率最高，達100％，引物UBC857擴增出的DNA條帶數為21，但多態性比率最低，為85.71％，引物UBC868和UBC900擴增出的DNA條帶數最多，為24，多態性比率分別為87.50％和95.83％，結果顯示，采用不同的ISSR引物對石榴進行PCR擴增，擴增出的譜帶數差異較大，但多態性譜帶的比例差異不大(表2)。篩選出的6條引物中，有3個二核苷酸重復序列，占50％，且重復序列都是(AC)，三核苷酸重復1個，占16.7％，混合基元的2個，占33.3％，雖然(AC)重復序列在植物2核苷酸重復中相對頻率只有1％，但是結果顯示，在石榴資源中(AC)重復序列錨定的堿基產生突變幾率較大。

2.3 石榴品種的DNA指紋圖譜

通過對47個石榴品種擴增圖譜進行分析，檢測到15條品種特異性條帶(表2)：山東冰糖石榴(D1)在UBC900-200bp(圖2)和UBC826-1800bp左右各有1條獨特DNA條帶，山東嶧紅一號(D2)在UBC868-600bp和UBC899-850bp左右各有1條獨特DNA條帶，陜西墨石榴(X2)在UBC868-1100bp左右有1條獨特DNA條帶，云南白花石榴(Y1)在UBC899-200bp及150bp左右各有1條獨特DNA條帶，云南花紅皮(Y7)在UBC857-1100bp左右有1條獨特DNA條帶，河南紅巨蜜(H6)在UBC826-900bp左右有1條獨特DNA條帶，安徽大笨籽(H1)在UBC846-850bp左右有1條獨特DNA條帶，牡丹黃花(N5)在UBC900-2800bp左右(圖2)有1條獨特DNA條帶；山東縮葉大青皮(D5)在UBC826-300bp左右缺失1條DNA條帶，陜西墨籽石榴(X4)在UBC868-1 200 bp左右缺失1條DNA條帶，四川水晶石榴(C1)在UBC826-400bp及UBC900-350bp左右(圖1)各缺失1條DNA條帶，此11條獨特及4條缺失特異性DNA條帶，可用作鑒定這11個石榴品種的分子依據。

2.4 石榴品種遺傳變異分析

試驗利用PopGen32軟件對石榴擴增的120條DNA條帶進行分析，結果表明，等位基因數(Na)為1.9083±0.2898，有效等位基因數(Ne)為1.2945±0.3094，Nei’s基因多樣性(H)為0.1897±0.1618、Shannon信息指數(I)為0.3091±0.2198，多態性條帶比率(P)為90.83％，結果表明，石榴品種間的遺傳變異較大，品種資源間存在比較豐富的遺傳多樣性。用NTSYSpc-2.10軟件計算47個石榴品種間遺傳距離(Dg)，其變異為0.0750-0.4000，平均為0.2233，其中山東嶧榴88-1(D3)與云南綠皮酸(Y4)的遺傳距離最大，為0.4000，表明兩者之間親緣關系最遠：新疆甜石榴(J2)與新疆紅皮石榴(J3)之間的遺傳距離最小，為0.0750，表明2者之間親緣關系最近，且2種形態特征也很相似，可能為同物異名，或者其親本相似。

2.5 石榴品種間的ISSR聚類分析

利用NTSYSpc-2.10軟件中的SAHN程序和UPGMA法，根據遺傳相似性系數(SG)構建47個石榴品種遺傳關系聚類圖(圖3)，從圖3可以看出，6條ISSR引物能將47個石榴品種完全區分開，以平均遺傳相似性系數(SG)0.7767為閥值，供試的47個石榴品種可分為5類：第1類僅冰糖石榴(D1)：第IV類僅紅巨蜜(H6)；嶧紅一號(D2)、嶧榴88-1(D3)、墨石榴(x2)為第V類；麻皮糙(D4)、黃花石榴(Y9)、天紅甜(X6)、月月紅(N9)、凈皮甜(X5)、河陰軟籽(N3)、天紅蜜(N2)、御石榴(X7)、火炮(Y5)、紅皮白籽(Y2)、墨籽石榴(X4)、玉石籽(H5)、酸石榴(兒)、水晶石榴(c1)、青皮軟籽(C2)、青皮白籽(Y3)、綠皮酸(Y4)、會理紅皮(C3)、江石榴(S1)、牡丹紅花(N4)、瑪瑙籽(H4)、大笨籽(H1)、白花石榴(Y1)為第1I類；縮葉大青皮(D5)、大青皮甜(D9)、河陰銅皮(N1)、魯石榴(D6)、泰山紅(D8)、粉紅牡丹(D7)、百日雪(X1)、牡丹白花(N6)、糯石榴(Y6)、瑩皮(Y8)、甜石榴(J2)、紅皮石榴(J3)、花紅皮(Y7)、火葫蘆(H2)、水粉皮(H3)、酸紅皮石榴(N8)、醉美人(X3)、牡丹黃花(N5)、牡丹花石榴(N7)為第1II類。

3 討論

ISSR分子標記是一種基于微衛星序列發展起來的新的分子標記，具有簡便迅速、穩定高效、DNA多態性高，同時克服了RFLP技術的局限性和RAPD的假陽性等優點。本研究利用ISSR標記對47個石榴品種進行遺傳多樣性的研究，6條ISSR引物多態性條帶比率在85.71％-100％，平均為90.83％，與采用ISSR分子標記對李(81.3％)、南豐蜜橘(82.35％)、山楂(86.4％)、杧果(87.25％)、櫻桃(95.97％)等所得平均多態性條帶比率相近，高于楊榮萍等㈣和熱娜·卡司木等利用RAPD分子標記石榴的多態性條帶比率72.07％及69％。研究表明ISSR標記技術能較好揭示材料間的遺傳變異，可用于分析石榴種下的遺傳多樣性和親緣關系，為石榴種質資源的保存、測定和良種培育提供依據。

從分子水平來說，遺傳距離的變幅越大，表明其遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越復雜，且該物種存在歷史越長遠㈣；有效等位基因數(Ne)、基因多樣度(H)與Shannon信息指數(I)是度量遺傳多樣性水平的常用指標。從本研究結果來看，47個石榴品種中遺傳距離(Dg)變異在0.0750-0.4000，等位基因數(Na)為1.9083±0.2898，有效等位基因數(Ne)為1.2945±0.3094，Nei’s基因多樣(H)為0.1897±0.1618、Shannon信息指數(I)為0.3091±0.2198，這表明石榴在我國經超過2000a的實生繁殖、人工選育及基因突變的積累，產生了較高的遺傳變異，構成了豐富的石榴品種資源基因庫，對石榴優良品種的選育是極為有利的。

目前，我國對石榴品種資源的分類還沒有統一的方法，研究利用ISSR標記技術將47個石榴品種分為5類，與形態分類的結果相差較遠，且沒有按照地域分布分類，與盧龍斗等舊利用RAPD分子標記對55個石榴品種進行分析所得結果一致。石榴種質在長期的自然選擇和人工選擇下積累了豐富的遺傳變異，遺傳組成異常復雜，加之地區間的引種交流更增加了其復雜性，使得某些品種遺傳相似系數較高聚為一類，但形態特征、地理來源及遺傳背景卻有較大差異；由于基因突變具有重演性——同一突變可以在不同地區同種生物的不同個體中多次發生，有的品種遺傳相似系數較低不能聚為一類，但卻表現出相似的形態特征。ISSR分子標記是對遺傳物質差異的直接反應，而形態分類是對遺傳物質差異的間接反映，同時還要受到環境作用的影響，因而應用ISSR標記技術對石榴種質資源進行遺傳關系研究，能更好的為石榴種質資源保存、利用及品種改良等提供科學依據。