高效檢測板栗群體基因頻率方法的建立

摘要：以17個板栗群體為試材，采用ABI全自動遺傳分析儀，利用5’端熒光標記的SSR引物，通過混合樣本中PCR產物檢測峰高與豐度對應，分析基因頻率，建立板栗群體混合樣本等位基因及其頻率的分析方法。與聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法相比，ABI全自動遺傳分析儀的檢測靈敏度高，熒光引物CmTCR10(NED)共檢測到78個等位基因，平均每個群體4.6個；引物CmTCR24(6-FAM)檢測到41個等位基因，平均每個群體2.4個。多重PCR熒光SSR檢測結果顯示。可以明確區分不同的等位基因。熒光SSR能準確地讀出片段大小，定量PCR擴增產物的豐度。用GeneScan獲取數據，用Genotyper軟件對數據進行設置與輸出，使用R軟件的FREQS-R模塊，初步探討利用熒光SSR定量化數據，計算供試群體混合樣本的等位基因頻率，可通過熒光SSR產物的豐度來確定混合取樣群體的基因頻率。

關鍵詞：板栗群體：SSR；多重PCR；混和樣本；基因頻率

中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)01-176-06

中國板栗(Castanea mollissima)是我國特有的殼斗科栗屬植物。由于具有堅果品質好、抗逆性強等優點。中國板栗是世界食用栗品種改良的重要基因來源。板栗群體中含有生態適應性的基因資源，是豐富的基因庫，對群體的遺傳多樣性和基因頻率分析將為這些材料的利用、進化及其野生近緣種的關系等研究奠定基礎。每個板栗群體單株混和取樣可以較全面地分析群體內的等位基因數、等位基因頻率、遺傳結構與稀有基因；群體遺傳多樣性分析的群體數目往往較多，群體中單株再分別進行基因頻率鑒定，工作量大；而且，群體中的單株大多是雜合狀態。對單株分別進行等位基因鑒定，也未必準確進行基因頻率分析。因此，有必要建立一種可以基于混合取樣的分析基因頻率的方法，以提高分析效率與準確性。

探討板栗群體遺傳多樣性分析的取樣策略，建立群體混合樣本中基因頻率的分析方法，是提高分析效率的有效途徑。Fonaari等對取樣的分析方法進行了比較研究，Hamrick探討了植物群體遺傳地域性分析的取樣策略。這些研究表明：建立高效檢測板栗群體基因頻率的分析方法，是提高分析效率的有效途徑。艾呈祥等對板栗群體混合取樣ISSR分析，進行了有益的探討，但由于常規SSR的PAGE膠分離銀染檢測法無法對產物進行定量，因此，很難應用于混合樣本的基因頻率分析。我們擬采用基于全自動DNA遺傳分析儀的SSR熒光標記檢測技術，用6-FAM、HEX和NED等熒光染料標記引物，精確分析擴增產物的片段大小和定量擴增終產物豐度。利用ABI全自動遺傳分析儀獲得混合樣本SSR擴增產物豐度數據，用GeneScan與Genotyper軟件進行圖像、定量分析與數據輸出，并探索使用R軟件對Genotyper輸出的信息進行混合樣本等位基因頻率分析，提高板栗群體基因頻率分析效率與準確性，拓展熒光SSR技術的應用范圍。篩選與目標性狀緊密連鎖的分子標記，以期為板栗的早期輔助育種提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料選用來自山東、河北、北京、遼寧、江蘇、陜西、四川板栗主產區7個省份的17份地方品種，每個群體的采樣株數為14-21株(表1)。采樣過程中，對于個體數大于20株群體按照均勻分布、隨機取樣的原則進行采樣，而對于個體數小于20株的群體進行全部個體采樣。本試驗所用的普通引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，引物信息除無熒光標記外(表2)。SSR引物的5’端分別用6-FAM、HEX和NED等進行熒光標記。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 以來自于國家果樹種質泰安板栗圃的17個板栗群體為試材，采用混合取樣法，從每個群體中選出14-21個單株，每個單株選取等質量葉片組成1g混合樣本，采用改良的CTAB法提取基因組總DNA。

1.2.2 PCR擴增 PCR擴增總反應體積為25μL，含2.5μL10×Buffer(100mmoI·L^-1Tris-HCl，pH8.3，500mmol-L^-1KCl)，2.0 mmol·L^-1MgCl₂，各引物0.5μmol-L^-1，250μm01·L^-1dNTP，1 U Taq DNA聚合酶和60ng模板DNA，反應在熱循環器MJ ResearchPTC100中完成。擴增循環反應：94℃5min；94℃50s，各引物對退火溫度45s，72℃90s，30個循環；72℃延伸7min。不同引物選擇適宜的退火溫度。

以新廟野板栗群體DNA為模板，選擇退火溫度相近的熒光引物CmTCR10和CmTCR21，進行多重PCR擴增，這2對引物檢測通道的顯色分別為藍色與黑色。PCR體系和擴增程序除引物為2對外，其他的同常規PCR擴增一致。

1.2.3 擴增產物變性和熒光檢測96孔板中，分別加入1μL6-FAM、2 μLNED、3μLHEX和22μL超純水，5000 r·min^-1離心1min。于PCR儀上95℃變性5min，立即置于冰上。在ABl3700 DNA分析儀上完成自動熒光檢測。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 25μLPCR樣品加入5μL6xloading Buffer，混勻后，在95℃變性5min，立即置于冰上。以pBR332/MspI片段為分子量標準。使用Seque-GenGT電泳系統(Bio-Rad，USA)，90W恒功率電泳約50min-1.0h，在6％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳。

1.2.5 數據分析 利用GeneScan和Genotyper軟件進行圖像分析與數據收集。用GeneScan掃描并分析SSR原始數據，設置分子量內標(Size Standard)和參數(Parameters)，讀取樣品最高峰，統計無峰樣品，計算每板樣品的通過率(成功率)，作為檢驗與糾正儀器電泳效果的依據。將無峰樣品比例控制在5％以內。Genotype軟件的Categories、Analysis、Tables菜單中的相關選項對起始片段大小、引物重復類型、域值、輸出項目等參數進行設置，建立表格。利用R軟件中的FREQS-R模塊對Genotyper輸出的信息進行分析，計算基因頻率。

2 結果與分析

2.1 多重PCR

以新廟野板栗群體的DNA樣品為模板，熒光引物CmTCR10和CmTCR21為多重PCR的引物組合，擴增產物在ABl3700上進行檢測，在分析數據或讀帶時，選擇不同的顯色通道，選擇0：內標顯紅色，選擇B：CmTCRl0引物5’端NED顯藍色，則顯示的圖譜為紅色內標峰和CmTCRl0擴增產物不同等位基因的峰(圖1-A)。引物CmTCR21擴增產物僅顯示黑色的不同等位基因的峰與紅色內標峰(圖1-B)。圖1-C為圖1-A與1-B的合成圖譜，結果顯示，不同引物擴增產物的區分度良好。

從Genotyper輸出數據中可提取片段大小、峰高等信息。在新廟野板栗群體中，多重PCR引物組合CmTCR10和CmTCR21的擴增產物區分度良好，沒有形成干擾，CmTCR10能擴增出分子量分別為177、189、195、206和212 bp這5個等位基因，CmTCR21則有152、158、167、175、184、189、201、209和215 bp共9個等位基因，兩引物的等位基因片段所在區間重疊，根據不同的檢測通道，分別讀出各等位基因的峰高(表3)。峰高值與擴增終產物的豐度對應，直接與定量及頻率換算相關。研究表明，熒光SSR分析結合多重PCR技術能明確區分各等位基因片段和定量，用于分析板栗群體混合樣本中等位基因頻率確實是可行的。

2.2 等位基因與基因頻率的分析

在17個供試群體中，引物CmTCR10(NED)共檢測到78個等位基因，平均每個群體為4.6個；引物CmTCR24共檢測到41個等位基因，平均每個群體為2.4個。本試驗CmTCR10常規引物擴增產物PAGE銀染圖譜中，僅在新廟野板栗群體中檢測出4個等位基因(圖2，第2泳道)；利用ABI全自動遺傳分析儀對同一樣本進行分析，可清晰地檢測出5個等位基因(圖1-A)，同時可在Genotyper中準確地輸出片段大小及與擴增產物豐度相對應的峰高值(表3)。

圖3為熒光引物CmTCR21對遵達栗群體19個個體的擴增結果。用Genotyper輸出數據，用R軟件的FREQS-R模塊，計算了西祥溝無花等9個群體(CmTCR24)及柞紅栗等8個群體(CmTCRlO)的混合取樣等位基因頻率(表4)。其中等位基因頻率最小值為柞紅栗的等位基因10(199bp)，頻率為0.045。基因頻率最高的為遵達栗的等位基因2(179bp)，達到0.855。分析表明，通過對產物的定量分析，可以獲得混合樣本中各個等位基因的頻率。

3 討論

本研究基于ABI全自動遺傳分析儀(AB13700DNA Analyzer)的熒光SSR片段大小的分析技術有效地解決了上述問題。可以準確地讀出每個等位基因片段大小，有利于不同批次樣品等位基因分析的數據統一；高度自動化與程序化，操作更為簡便，省時省力。AB13700或AB13730毛細管型自動測序儀和與之匹配的軟件直接進行程序化、數據化和圖像化處理；可以精確定量擴增產物，該系統依據定量PCR原理，對PCR產物乃至模板DNA中某一基因型進行定量分析。在等位基因頻率、SSR定量分析方面有廣闊的應用前景；效率更高，分析通量大。通過多重PCR，還可進一步提高效率。

前人研究表明15-20個單株可以較好地代表一個群體tg，13-t41。Siffverberg等舊用多重PCR SSR熒光標記分析技術和常規的變性PAGE銀染技術分析178份蘋果樣品、142個位點后，對這2種方法的費用做了比較，結果表明，完成178×142個反應，在不考慮儀器成本的前提下，這2種的費用基本持平，但SSR熒光標記分析技術的效率顯著高于變性PAGE銀染檢測法。Pinar等利用熒光檢測法在50h內就完成了198份樣品約1000個位點的分析。SSR熒光檢測系統建立的高通量、高效率、高精確性的DNA自動分析技術，尤其適合大規模材料的分析研究。常規的SSRPAGE銀染技術由于不能定量，只能通過分別提取單株DNA，分別擴增，分析群體內的基因頻率，然后比較群體間的基因頻率。以15個群體，每個群體取15個單株，60對引物計算，單株取樣法需提取225份DNA，13500個SSR-PCR反應，還有大規模的PAGE銀染工作量。用混合取樣法，只需提取15份DNA，900個SSR-PCR反應，是前者工作量的6.67％。而且，應用ABI全自動遺傳分析儀，自動化程度高，總體效率是前者的30倍以上，如果應用上述多重PCR技術，效率還會進一步提高。更重要的是，熒光SSR分析技術還具有讀帶精確，數據格式一致，不存在數據整合的障礙。

拓寬熒光SSR技術的應用范圍，篩選與目標性狀緊密連鎖的分子標記，從而進一步縮短果樹的育種周期。目前，國家果樹種質泰安板栗圃正在利用本技術開展野板栗居群SSR分析、群體等位基因頻率分析、SSR定量分析等項研究。

致謝：衷心地感謝澳大利亞南澳洲發展研究所基因研究中心Klaus Oldach博士在數據處理方面提供的幫助。